Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы

Способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТА-ТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ГЛ10КОАМИЛАЗЫ, предусматривающий приготовление суспензии муки , введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, о тлич - с я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса приготовления питательной среды, в суспензию муки дополнительно вводят пшеничные отруби , а также пектолитические ферRnr l :iti- .f iATHt;;f o. 13 13 ТГХН; 4М:%А«( К«1КЛИ01НЪ Гменты, причем содержание муки и отрубей в суспензии соответственно, 10-14 и 4-8 мас.%, а фрагменты вносят в суспензию в следующих количествах , ед/г смеси муки и отрубей: . Амилолитические ферменты1,5-10 Целлюлолитические ферментыО,1-1,0 Пектолитические ферменты0,1-1,0 2.Способ по п., отличающийся тем, что в сусп ензию муки дополнительно вносят протеолитическне ферменты в количестве 0,11 ,0 ед/г смеси муки и отрубей. 3.Способ 1ю ПП.1 и 2, отли (Л чающийся тем, что, с целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы,из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гидролизат крахмала, а источники азота и минеральных солей вводят в смесь гидролизатов крахмала и суспензии муки и отрубей.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ае а

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

М ABTOPCHOIVIY СВИДЕ ПЛЬСТВУ (21) 3289227/13 (22) 13.05.81 (46) 23,03,84.Бюл.К 11 (72) Г.В.Черкасова, Т.В.Полянская, Н.А.Беляева, И.М.Фроловский и Б.А.Величко (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (53) 557.15(088.8) .(56) 1. Патент США М - 3988204, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1976.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 795027, кл. С 12 N 9/34, 1979, (54)(57) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТА-ТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ПРОДУЦЕНТОВ ГЛ10КОАМИЛАЗЫ, предусматривающий приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, о т л и ч а ю щ й— с я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса приготовления питательной среды, в суспензию муки дополнительно вводят пшеничные отруби, а также пектолитические ферЗ(Я) С 12 N 9/34 С 12 N 1/20

Гменты, причем содержание муки и отрубей в суспензии соответственно, 10-14 и 4-8 мас.Е, а фрагменты вносят в суспензию в следующих количествах, ед/г смеси муки и отрубей:

Амилолитические ферменты I 5-10

Целлюлолитические ферменты 0,1-1.,0

Пектолитические ферменты 0,1 †l

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в суспензию муки дополнительно вносят протеолитические ферменты в количестве 0,1I 0 ед/г смеси муки и отрубей.

3, Способ по пп.1 и 2, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы,из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гидролизат крахмала, а источники азота и минеральных солей вводят в смесь гидролизатов крахмала и суспензии муки и отрубей.

1081209

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу приготов25 ления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы, предусматривающеглу приготовление суспензии муки, введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиэ суспензии, добавления в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, в суспензию муки дополнительно вводят пшеничные отруби, а также пектолити35 ческие ферменты, причем содержание муки и отрубей в суспензии соответственно 10-14 и 4-8 мас., а ферменты вносят в суспенэию в следующих ко40 личествах ° ед/Г смеси муки и отру бей:

Амилолитические ферменты 1,5-10

Целлюлолитические ферменты

Пектолитические ферменты 0,1-1

8 суспенэию муки также дополнительно вносят протеолитические ферменты в количестве 0,1-1 ед/г

50 смеси муки и отрубей.

0,1 — 1

Изобретение относится к микробиологической отрасли промышленности, в частности к ферментной, а именно к приготовлению питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилазы.

ИзвестЬн способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамйлазы, предусматривающий приготовление 16-20 10 суспензии кукурузной муки, разваривание суспензии муки при 149-176ОС (давление 5-12 атм )в течение 3035 мин, охлаждение разваренной массы, внесение амилолитических ферментов в виде солода в количестве 1-3 к весу муки, гидролиэ муки при 63 С, о охлаждение гидролизата до 33-37 С, о добавление глутаминовой кислоты, стерилизацию среды и охлаждение ее.

Приготовленную таким образом среду засевают продуцентом глюкоамилазы, в качестве которого используют

Aspergillus avamori и культивируют продуцент до максимальной активности глюкоамилаэы в среде (160-290 ч )(1).

Недостатками такого способа являются разваривание муки при высоких температурах, что требует наличия специальной аппаратуры и расходование значительного количества электроэнергии, применение солода, для

t приготовления которого используется высококондиционное зерно, получаемая среда вязкая, что затрудняет процесс. аэрации среды, в связи с чем увеличивается продолжительность процесса культивирования.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигае.мому положительному эффекту является способ приготовления питательной среды для культивирования продуцентов глюкоамилаэы, предусматривающий приготовление суспензии муки„ введение в суспензию амилолитических и целлюлолитических ферментов, гидролиз суспензии, добавление в гидролизат источников азота и минеральных солей с последующей стерилизацией среды, При этом суспензию муки разваривают при 127-138 С (1,52,5 атм ) в течение 1,5-2 ч, амилолитические ферменты вводят постадийно, сначала в количестве 0,2-0,5 ед/г муки в суспенэию муки, охлажденной до 95-90 С и затем после снижения температуры до 85-80 С в количесто, ве 0,8-0,5 ед/г одновременно с крах2 малом, а препараты пектиназы (Пк) или целлюлазы вводят после 10-минутного гидролиза амилазами (А ), внесения остальных компонентов среды, доведением рН до 4,5 в количестве

0 5 ед ПкА или .1 ед суспензии на ! г сухих взвешенных веществ среды.

Гидролиз осуществляют в течение 1 ч, доводят рН до 6,0 и стерилизуют среду )23, Недостатком известного способа является раэваривание суспензии муки, что требует больших энергозатрат и мнократный гидролиз крахмалсодержащего сырья, что значительно усложняет процесс приготовления среды.

Целью изобретения является ускорение и упрощение процесса приготовления питательной среды.

С целью использования среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы из полученного гидролизата суспензии муки и отрубей выделяют жидкую фракцию, в которую дополнительно вводят гидролизат крахмала, а источники

4 ветственно равных 1,5-10 ед и О,11 ед на 1 г смеси муки и отрубей и суспензию прогидролизовать при 7090 С в течение ?0-60 мин.

Пример 1. В ферментер Биолафит Б-50 наливают 5 л воды, включают мешалку и, подогрев до 40 С,вноо сят 1,8 кг муки, затем наливают еще

5 л воды и вносят 0,6 кг пшеничных отрубей, объем суспенэии доводят до

14,4 л,рН суспензии устанавливают

5,0 и вносят 0,8 г амилосубтилина

Г 10х, 0,48 r целловиридина ГЭх и 8,9 r пектофостидина ГЭх, растворенные в воде (0,6 л ), температуру суспензии поднимают до 50 С и вью держивают 30 мин, затем температуо ру поднимают до 85 С, выдерживают

10 мин. Полученный гидролизат при окрашивании иодом не изменяет окраски.

Затем в гидролизат вносят вытяжку солодовых ростков 0,75 л „(МН4.) 80

90 г,KHZP04 15 r, MgS04 7,5 и. Приготовленную таким образом среду стео рилиэуют при 121 С в течение 40 мин„ охлаждают, засевают продуцентом глюкоамилаэы Aspergillus awamori и культивируют при 33оC в течение 120 ч при аэрации и перемешиваний. В процессе культивирования отбирают пробы.

Активность глюкоамилаэы в глубинной культуре через 96 и 120 ч культивирования соответственно равной 168 и

118 ед/мл (по глюкозооксидазному методу 1.

В контрольном опыте при культивировании этого же штамма на среде, приготовленной по известному спо собу (2) активность глюкоамилаэы в глубинной культуре на 120 часу роста равна 121 ед/мл °

Пример 2. В ферментер Биолафит Б-50 наливают 5 л воды, включают мешалку и, подогрев до 40 С, вносят о

1,5 кг муки, затем наливают еще 5 л воды, вносят 1,2 кг пшеничных отрубей, объем суспензии доводят до

15 л,рН,суспензии устанавливают 4,5, вносят 54 г целловиридина ГЗх и

100 г пектофостидина ГЗх, температуру суспензии поднимают до 50 С, о выдерживают при этой температуре

60 мин, затем рН суспензия устанавливают 6,0 и вносят. 0,9 г амилосубтилина Г10х, растворенного в воде, поднимают температуру до 85 С, вью держивают при этой температуре

20 мин, затем в полученный гидролиз

108120 азота и минеральные соли вводят в смесь гидролиэатов крахмала и суспензии муки и отрубей.

Способ осуществляют следующим образом. 5

Готовят суспензию, содержащую 1014 мас.Ж муки и 4-8 мас,7. пшеничных отрубей, рН суспензии устанавливают равным 4,5-6,3, полученную суспензию нагревают до 40-60 С и вносят амило- 10 литические, пектолитические и целлюлолитические ферменты в количествах соответственно равных 1,5-10 и по 0,1-1 ед/г смеси муки и отрубей, о суспензию выдерживают при 45-90 С в течение 0 5-2,0 ч.

При использовании среды для периодического культивирования продуцентов глюкоамилаэы,в полученный гидролизат вносят источники азота,в р0 качестве которого могут быть использованы дрожжи, автолиэат дрожжей, солодовые ростки, вытяжка солодовых ростков, кукурузный экстракт, соли аммония, азотнокислые соли и источ- 25 ники фосфора — фосфорнокислые соли.

Приготовленную таким образом среду стерилизуют 40-60 мин при 121 С.

При использовании среды для непрерывных процессов культивирования продуцентов глюкоамилазы из полученного гидролизата муки и отрубей выделяют жидкую фракцию фильтрованием или центрифугированием, В жидкую фракцию гидролиэата вносят гид35 ролиэат крахмала, источники азота и фосфорнокислые соли. Полученную сре.— ду стерилизуют и охлаждают, Ферменты можно вносить одновременно, при этом гидролиз проводят в две стадии, 40 первую — при рН 5,5-6,3, температуре 45-55 С в течение 10-60 мин, а вторую — при 70-90 С в течение 2060 мин или первую стадию — при рН 4 5о

Э

5,0,температуре. 45-55 С в течение

20-60 мин, а вторую " при рН 5,86,3, температуре 70-90 С в течение

10-40 мин. Указанные ферменты можно вносить последовательно.

В приготовленную суспензию муки и отрубей с рН 4,5-5,0 можно вначале .50 внести петолитические и целлюлолитические ферменты в количестве 0,11,0 ед на 1 r смеси муки и отрубей, гидролиз осуществить при 45-55 С в течение 30-60 мин, затем рН изменить до 5,8-6,3 добавлением аммиака, внести амилолитические и протеолитические ферменты в количествах соотСоставитель Е.Воробьева

РедактоР Н.РогУлич 1 ТехРеД Т.ДУбинчак КоРРектоР Д.Пилипенко

Заказ 1478/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

S 1081209 зат вносят вытяжку солодовых ростков1 и соли, как описано в примере 1.

Приготовленную среду стерилизуют при этом же режиме, охлаждают до

40 С и вносят посевной материал 5

Aspergi11us awamori. Культивируют при 33 С, перемешивании и аэрации о в течение 120 ч. Активность глюкоамилазы в глубинной культуре состав.ляет 128 ед/мл. 1О

П р и Й е р 3, Приготовление ape" ды осуществляют так же, как в примере 1, но наряду с амилолитическими„ пектолитическими и целлюлолитическими ферментами в суспензию муки и 15 отрубей вносят протеолитические ферменты в количестве 34,3 г.

При культивировании Аврег811:1us ажашогх на данной среде активн::сть глюкоамилазы на 120 ч равна 20

137 ед/мл.

Пример 4 ° Приготовление гидролизата суспензии муки и пшеничных отрубей осуществляют .так же, как описано в примере 1. Полученный гидро- 25 лизат фильтруют, твердую фазу используют дав .:: -;"1:ного гидролиза, а в жидкую ыаэ:,: гидролизата муки и от- рубей члосят 0,4э л гидролизата 10% суспен. †.;;и крахмала„0,15 л кукурузноI o экстра:.та. 0,60 л экстракта биомассы и соли, укаэанные в примере 1.

Полученную среду стерилизуют, охлаждают, засевают Аврегф11из ачашо"

ri, культивируют при 33 С, аэрации и перемешивании в течение 96 ч. Активность глюкоамилазы в глубинной культуре составляет 112 ед/мл, затем включают поток со скоростью

0,0208 ч "и продолжают непрерывный процесс культивирования в течение

lO сут. Средняя активность глюкоамилазы в глубинной культуре составляег 65-75 ед/мл, Таким образом, реализация предлагаемого изобретения позволит ускорить и упростить процесс приготовления среды, а также снизить затраты электроэнергии и расход муки„сохранив высокую активность глюкоамилазы.