Способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов

Способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОГРУПП В ПЕПТИДШЪ ПОЛИМЕРЕ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ СИНТЕЗЕ ПЕПТИДОВ путем отбЪра пробы пептидилполимера и последукнцей последовательнойобработки ее раствором основания , органическим растворителем, раствором кислоты, органическим растворителем и раствором основания и последующим определением ионогенно связанной со свободными аминогруппами пептидил-полимера кислоты спектрофотометрическим способом, о т л и ч а root и и с я тем, что, с целью снижения расхода пептиднл-полимера и органических растворителей и сокращения продолжительности определения, отбор щ Проб осуществляют капилляром с фильтс рующей перегородкой и последующую обработку пробы ведут в капилляре под давлением 0,1-2,0 кг/см.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБ ЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

tl ABT0PCK0MV CCllEIC0bCTCV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬ1ТИЙ, (21) 3353734/23-04 (22) 06.11.81 (46) 07.04.84. Бюл.913 (72) У.О. Калей, Н.Н. Подгорнова и Г.П. Власов .(53) 547.964.4.07(088.8) (56) 1. Хирт Дж., Леер 3.де, Бейер-: ман Х. Контролирование твердофазного синтеза пептидов.-В сб. "Химия поли- пептидов" под ред. П.Катсояниса.И., 1977, с. 404.

2. Билибин А.Ю., Власов Г.П."Получение аминоацил.-сефадексов и использование и-толуолсульфокислоты для определения их емкостей",ЖОХ, 44, 1844 (1973).

3. Билибин А.Ю., Кожевникова Н.В

Власов Г.П.. "Изучение стадии ацили-: рования при синтезе пептидов на поли" . мерных носителях", ЖОХ, 47, 217 (1977).

4.ЕЛзга1й, .D. Andreu, L. Rafeeas. Effect of thri flu roacetic

acid upon рос — aminoacyl and pocpepfidyl - Resins. Description of a

new polymeric support for solid

phase peptide Synthesis.-Tetrahedron

Zett, 1979, 3587 (прототип). (19) (11)

y(g) С 07 С 103/52//G, 01 М 21/78 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОГРУПП В ПЕПТИДИЛ"

ПОЛИМЕРЕ ПРИ ТВЕРДОФАЗНОМ СИНТЕЗЕ

ПЕПТИДОВ путем отбора пробы пептидилполимера и последующей последовательной обработки ее раствором основания, органическим растворителем, раствором кислоты, органическим растворителем и раствором основания и последующим определением ионогенно связанной со свободными аминогруппами пептидил-полимера кислоты спектрофотометрическим способом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью снижения расхода пептидил-полимера и органических растворителей и сокращения продолжительности определения, отбор проб осуществляют, капилляром с фильт" рующей перегородкой и последующую обработку пробы ведут в капилляре под давлением О, 1-2,0 кг/см .

1 1084

Изобретение относится к усовершенствованному способу определения содержания свободкых аминогрупп в пептиднл-полимере при твердофазном синтезе пептидов и может найти применение в синтезе биологически активных пептидов твердофаэным методом.

В настоящее время в синтезе пептидов широко используется твердо- 10 фаэный метод, который заключается в последовательном наращивании пептидной цепи, начиная с С-концевой аминокислоты, ковалентно присоединенной к нерастворимому полимерному 15 носителю f1 .

Процесс твердофазного синтеза

I пептидов включает последовательное чередование стадии деблокирования— удаление — концевых защитных групп ур и.стадии конденсации — присоединениезащищенной аминокислоты.

Наиболее важным условием для успешного синтеза пептидов твердофазным методом является количественное sa- . 25 вершение всех реакций, так как очистка промежуточных продуктов невозможна. Степень завершенности химических. реакций. определяется количествами свободных аминогрупп

30 в пептидиш.-полимере. В идельаном случае квМйчество свободных амивогрупп s пфцФндил-полимере при деблокировании должно равняться общему содержанию пептидных остатков в полимере, а при конденсации

35 должно снижаться до нуля.

Однако из-эа неполного прохождения реакций, а также иэ-за побочных реакций, протекающих в процессе синтеза, необходим контроль всех-стадий твердофазного синтеза пептидов. Этот контроль осуществляют путем определения содержания свободных амнногрупп в пептидилполимере после стадий деблокирова- 45 ния и конденсации.

Большинство известных способов определешия содержания свободных аминогрунн в пептидил-полимере основано на способности свободных амикогрупн стехиометршчески образовывать соли с кислотными агентами.

Известен способ определения свободных айиие1Групп s иептядил-попимере, которйй включает обработку всего пепмщвл-неаимера нейтральным органическим растворителем, кислотным агентом, органическим растворителем

271

2 и раствором основания для высвобожде ния ноногенно связанного со свободными аминогруппами кислотного агента, количество которого определяют снектрофотометрически (23и(3 3.

В качестве кислотного агента используют и -толуолсульфокислоту Г23 илн кислотный ярко-оранжевый (3).

К недостаткам этого способа следует отнести использование всей массы полимера или довольно большой навески полимера и большие затраты времени на проведение анализа.

Обработка всей массы полимера создает опасность взаимодействия основных группировок пептидной цепи с аналитическим реагентом, что мо жет привести к искажению результатов анализа. Кроме того, обработка всей массы полимера приводит к расходу больших количеств органических растворителей и аналитических реагентов.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере при твердофазном синтезе пептидов, включающий отбор пробы пепдидилполимера и последующую ее обработ-, ку органическими растворителями и пикриновой кислотой в качестве кислотного агента. Согласно этому способу пробу пептидил-полимера весом

50 мг помещают на взвешенный фильтр, промывают дихлорметаном, сушат до постоянного веса и определяют вес пробы. Затем пробу промывают дихлорметаном, обрабатывают раствором триэтиламина, дихлорметаном, дважды обрабатывают раствором пикриновой кислоты в дихлорметане и промывают дихлорметаном. Ионогенно связанную с аминогрупками кептидил-полимера пикриновую кислоту высвобождают обработкой раствором триэтиламина в дихлорметане. Количество соли триэтиламина с пикриновой кислотой определяют спектрофотометрнчески f4).

К недостаткам этого способа следует отнести большой расход пептидил-полимера и органических растворителей для проведения одного анализа и большой расход времени ка проведение анализа 60-90 мин, что снижает производительность способа.

Цель изобретения — снижение расхода пептидил-полимера и органичес Таблица 1

Объем пропущенного раствора (мл на одну пробу) Время подачи, мин

Раствор

107-ный триэтнламин в дихлорме2,5 тане

Дихлорметан

0 5 н. пикриновая кислота

Дихлорметан

107-ный триэтиламин в дихлорметане

19,5

Итоro:

Вытекающий из капилляров раствор

У5, который содержит пикриновую кислоту, собирают отдельно:и разбавляют ацетоном до объема 200 мл.

Концентрацию пикриновой кислоты определяют спектрофотометрически при 362 нм по калибровочным кривым.

Полученные результаты представлены в табл.2. з 10842 ких растворителей и сокращение продолжительности определения содержания свободных аминогрупп в пептидил. полимере при твердофазном синтезе, Поставленная цель достигается

5 тем, что согласно способу определения содержания свободных аминогрупп в пептидил-полимере отбирают пробы пептидил-полимера капилляром, с фильтрующей перегородкой и последовательной обработки пробы в капилляре органическими растворителями, раствором кислотного агента и раствором основания под давлением 0,12,0 кг/см2.

Осуществление предлагаемого способа позволяет снизить расход пептидилполимера до 4-8 мг и органического растворителя для проведения одного анализа до 7-70 мл (с 220 мл), сокра- >0 тить время проведения анализа до

25-40 мин (до 90 мин в известном способе).

Сущность предлагаемого способа заключается в отборе пробы пептидилполимера из реакционной среды точно взвешенным капилляром с фильтрующей перегородкой, который после отбора пробы подключают к резервуару с раст. ворителем и интенсивным потоком

30 растворителя под давлением отмывают от реагентов синтеза. Затем ка-. пилляр с пробой сушат до постояйного веса, взвешивают, подсоединяют к распределительному устройству и поочередно под давлением пропускают непрерывно следующие реагенты:

1. Раствор тризтиламина в органическом растворителе.

2. Органический растворитель.

3. Раствор кислоты в органическом растворителе.

4. Органический растворитель.

5. Раствор триэтиламина в органическом растворителе.

Раствор ¹5,который вытекает из капилляра, собирают отдельно для спектрофотометрического определения содержания кислоты, ионогенно связанной со свободными аминогруппами пептидил-полимера.

Количество кислоты, высвобожденной при обработке раствором триэтил" амина, эквивалентно содержанию свободных аминогрупп в пробе. пептидилполимера.

Пример 1. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил. глицил-сефадекса.

71 4

1,0 r гранул трет-бутилоксик..1рбонил-глицил-сефадекса помещают в реакционный сосуд, добавляют 5,0 мл 50Хного раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане.

Через определенные промежутки времени с помощью взвешенного капилляра с фильтрующей перегородкой отбирают пробы полимера. Затем капилляр подсое диняют к трубке для подачи органических растворителей и аналитических реагентов и пропускают в течение

5 мин под давлением 1,0 кг/см2 дихлорметан и сушат до постоянного веса в вакууме и взвешивают. Затеи обработку проб в капиллярах осуществляют под давлением 1,0 кг/ см сог2 ласно программе, приведенной в табл. 1.

1084271

Таблица 2

Продолжение табл.3

Содержание свободных аминогрупп на 1 г глицил-с ефадекса (Им/г) Вес

Количество вымытой пикриновой кислоты

Время отбо ра, мин

2 3 пробыь

r у Дихлорметан

20 2

107-ный триэтиламин в дихлорметане

1,8

0,45

10 И т о г о:

6,8

5 60 320

0,53

10 6,5 3,78

15 6,3 3,30

20 6,0 3,08

0,58

Таблица 4

0,52

Содержание свободных амсногрупп на 1 кг глицил-сефадекса

Им/г

Время отбоВес Количество

ПРб- BblMb1ToA бы, пикриновой г кислоты

0,51 ра, 20

0,52

30 6, 75 3,52

40 5,7 2,80

60 6,0 3,08

90 5,5 2,68

120 5,3 2,80

0,49

0,51

0,42

0,49

5 6,8

10 6,7

З0 15 5,7

20 6,0

3,47

0,51

3,69

0,53

0 55

3,25

0,57

3917

0,53

3,15

Зо 6З

40 6,1

0,50

0,58

3,54

60 6,?

3,68

0,55

2,97

40 90 5 4

0,55

120 7,1

3 48

0,49

Таблица 3

10Х-ный триэтиламин

1

Дихлорметан

0,5 н. пикриновая кислота

2,5 6,6.1(Г 2,9 10 З

Пример 2. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил-глицил-сефадекса.

1,0 г трет-бутилоксикарбонил-3 глицил-сефадекса подвергают деблокированию аналогично примеру 1. Пробы промывают 10 мин в капиллярах, дихлорметаном под давлением

0,1 кг/см2 и затем обрабатывают аналогично примеру 1 с тем отличием, что обработку проводят под давлением

0,1 кг/см2 по программе, прицедеиной в табл.з.

Полученные результаты представле. ны в табл.4.

2,5 5,9 ° 1032i48 }О

45.

Пример 3. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил-глицил-сефадекса.

1,0 г трет-бутилоксикарбонил-гли. цил-сефадекса подвергают деблокированию аналогично примеру 1. Дальнейший контроль осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что промывку проб в капилляре осуществляют в течение 4 мин дихлорметаном под давлением 2,0 кг/см, а дальнейшую обработку проводят под давлением.

2,0 кг/см по программе, приведенной, 2 в табл.5..

1084271

Таблица 5

Объем пропущ. раствора, мл, на 1 пробу

Время подаРаствор чи, мин

10Х-ный триэтиламин в дихлорметане

Дихлорметан

0,5 н..никриновая кислота в дихлорметане

Дихлорме ган

10Х-ный триэтиламин в дихлорметане

8, 8

28 27,5

Итого:

Таблица7

Стадия

¹ Таблица,6

Содержание свободных аминогрупп иа 1 г глицил-сефадек. са (Им/г) З5

Время отбора, мин

Вес

Количество вымытой пикриновой кислоты (и) про" бы, г

0,23

t

0,26

0,26

0,44

16,5

0,27

5 6,6 3,76

0,57

2,86

10 5,2

15 6 5 3 20

0,50

3,01

0,51

20 5,9

30 61 3 24

40 6,0 3,36

0,53

0,56

60 6,1

90 5,7

90 6,2

0,54

3,29

3,36

3,22

0,52

120 5 9 . 3 О?

0,52

Полученные результаты представлены в табл.б. р

2,5 6,8 ° 1632,99-10

Пример 4. Контроль реакции деблокирования трет-бутилоксикарбонил лейцил-глицил-оксиметил-полистирола, привитого на макропористом тефлоне.

5 23 г пептидил-полимера деблоки руют в синтезаторе пептидов"Beckman990" по приведенной программе:

1. Промывка дихлорметаном.

2. Обработка 50Х-ным раствором трифторуксусной кислоты в течение 20 мин.

3. Повторение стадии 2.

4. Промывка диоксаном.

5. Обработка 4 н. раствором хлорис5 того водорода в диоксане в течение 15 мин. с

6 Повторение стадии 5

После каждой обработки деблокирующим реагентом отбирают пробу пептидил-полимера и определяют содержание свободных аминогрупп аналогично примеру 1.

Результаты определения представлены в табл.7.

Вес пробы, Содержание

10 5г свободных аминогрупп на

1 г пептидилполимера (мИ/г) - 40

Пример 5 Контроль реакции конденсации трет-бутилоксикарбонилпролина с пролил-глицил-фенилаланил(О-бензил)-серил-пролил-сефадексом.

Ф К пролил-глицип-фенилаланил-045 . бензил-серил-пропил-сефадоксу, полученному .путем последовательного наращивания пептидной цепи, исходя из

5 r пролил«сефадекса с содержанием пролина 0,2 ммоль на 1 кг полимера прибавляют раствор 0,,33 г (1,5 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-пролина в

20 мл дихлорметана. Через 15 мин прибавляют раствор 0,31 г (1,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл ди. 55 хлорметана. Ход реакции контролируют путем отбора проб пептидил-полимера капилляром с фильтрующей перегородкой.

Обработку проб и определение содержа-

9 1084271 ния свободных аминогрупп в пептидилполимере осуществляют аналогично при-. меру 1. Полученные результаты представлены в табл. 8.

Таблица 9

О, 10

8,5.Таблица 8 5

0 85

Содержание свободных аминогрупп

10 на 1 Г пеп- 60 тидилс ефадекса, (мМ/г) 8,0

0,30

0,06

Время Вес проотбора, бы, 10Г r

3 мин

Количество вымытой

7,8

0,01

0,001

0,000 пикулино вой

0,00 кислоты

0,77

0,17

0,14

0,57

0 56

0,10

0,25

0,04

0,14

0,02

0,02

0,002

0,001

0,002

0,000

0,01

Таблица 10

0,02

Раствор

Время подачи, мин

0,00

Пример 6. Контроль реакции конденсации трет-бутилокси-карбонилфенилаланина с лейцилсефадексом.

К 10 г лейцил-сефадекса с содер.жанием лейцина 0,60 ммоль на 1 г приливают свежеприготовленный раст-вор симметричного ангидрида третбузоксикарбонил-фенилаланина, приготовленный из 6,36 г (24 ммоль) защищенной аминокислоты и 2,5 г (12 ммоль) дициклогексилкарбодиимида.

Ход реакции контролируют путем отбора проб пептидип-полимера.и опре-45 деления в них содержания свободных амин огрупп аналогично примеру 1 . Полученные результаты представлены в табл.9.

Таблица 9

10Х.-ный триэтиламин в дихлорметане

Этиловый спирт

Этиловый спирт

10Х-ный триэтиламин в дихлорметане

Итого:

Вытекающий из капилляров раствор е50 Ф5 собирают для каждой пробы отдельно (3-5 мл) и упаривают досуха на ротап ционном испарителе, остаток раствои- ряют в воде, разбавляя в мерной колбе до объема 10 мл. Концентрацию и -тоt

55 туолсульфокислоты определяют спектрофотометрически при 260 нм.

Данные анализов приведены в табл. Il..

1,06

0,97

0,15

0,13

2,5 7,0

«7 7,5

2,5 4,5

5 4,0

10 5,8

20 6,8

30 6,8

45 6,0

60 6,0

90 5,0

120 7,0

Пример 7. Контроль реакции деблокирования трет-бутнл-оксикарбонил-лейцил-сефадекса.

К 1 r трет-бутилоксикарбониллейцил-сефадекса прибавляют 5 мл 1 и. раствора h --толуолсульфокислоты в уксусной кислоте и через определенные промежутки времени отбирают пробы пептидил-полимера как описано

Я в примере 1. Дальнейшую обработку проб осуществляют аналогично примеру 1 с тем отличием, что обработку проб осуществляют под давлением .2,0 кг/см по программе, приведенной

2 ниже.

0,5 N раствор п-толуолсульфоната пиридиния в днхлорметане

1084271 12 л и ц а 11 Отбор пробы пептидил-полимера с помощью капилляра с фильтрующей

Содержание перегородкой н проведение последую« свободных о щей обработки пробы растворителяаминогрупп ми и аналитическими .реагентами под на 1 г ами-, -:давлением 0,1-2,0 кг/см2 позволяет ноацил-сеснизить расход пептидил-полимера фадекса цля проведения одного определения (мИ/гг до 4-8 мг, а расход органи16 ческих растворителей с 220 мл

0,33

0,46

0,51

0,56

0,56

11

Таб

Вре отб

Раэ мин

Количество выиытой и-толуолсульфокислоты (10 И) Э Ф

5 9,3

15 6,6

30 8,2

45 8,0

60 8,0

90 8,0

2,15

2,0

3,8

4,1

4,5

4,5

Отсутствие периодического перемешнвания и последующей фильтрации

fS .позволяет сократить расход времени на одно определение с 90 мин до

30-40 мин.

Составитель О. Галкин

Редактор А. Долинич Техред Т.факта Корректор А. Tacrco

Заказ 1919/18 Тараа 4f0 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

f13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ухгород, ул. Проектная, 4