Способ получения антигена для серологической диагностики сальмонеллеза

Способ получения антигена для серологической диагностики сальмонеллеза

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА для серологической диагностики сальмонеллеза путем выделения липолисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции 90%-Ным раствором фенола, отличающийся тем, что, с целью повьппения специфичности диагностики сальмонеллеза группы В, после йодно-фенольной экстракции дополнительно смешивают 0,5-1,0%-ньй ,, раствор липополисахарйда в нейтральном забуференном физрастворе с равным объемом 0,,00t)15 М раствора периодата калия, вьщерживают в течение 1 ч, нейтрализуют действие периодата калия добавлением 2%-ного раствора глюкозы.

СООЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) g(5g С 12 К 1/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,,;:.

Н АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЪС ГВУ (21) 3485273/28-13 (22) 25.08.82 (46) 07.04.84. Бюл., Ф 13 (72) А.Л.Лазовская, Е.О.Коннина, О.И.Мызина и Е.Е.Жданов (71) Горьковский научно-исследовательский институт эпйдемиологии и микробиологии (53) 616.981.49(088.8) (56) 1. ЖМЭИ, 1969, В 11, с.111-115.

2. Адамс Г.А.Липополисахариды.

В кн. "Методы исследования углево. дов" ° N. "Мир", 1975. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА для серологической диагностики сальмонеллеза путем выделения липолисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции

90Х=ным раствором .фенола, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности диагностики сальмонеллеза группы В, после водно-фенольной экстракции дополнительно смешивают 0 5-1,0Х-ный раствор липополисахарида в нейтральном забуференном физрастворе с равным объемом 0,0005-0 00д15 М раствора периодата калия, выдерживают в течение 1 ч, нейтрализуют действие периодата калия добавлением 2Х-ного раствора глюкозы.

55

Изобретение относится к иммунохнмии, преимущественно к получению (пологических диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики сальмонеллезов группы В.

Известные способы получения антигена для диагностики сальмонеллеза не позволяет получить препарат с необходимой антигенной специфичностью (1) .

Известен способ получения анткгена для серологической дйагностикн сальмонеллеза путем выделения липополисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции 90Х-ным раствором фенола (2) .

Однако полученные таким образом липополисахаридные антигенные препараты проявляют в серологических реакциях недостаточно выраженную специфичность, поскольку не удается получить моноантигены группы В.

Целью изобретения является повышение специфичности диагностики сальмонеллеза группы В..

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения. антигена для серологической диагностики сальмонеллеза путем выделения липополисахарида из биомассы сальмонелл с помощью водно-фенольной экстракции 90Х-ным раствором фенола, после водно-@eHoabHoA экстракции дополнительно смешивают 0,5-1,0Х-ный раствор.липополисахарида в нейтральном забуференном физрастворе с равным объемом 0,0005-0;00015 М раствора периодата калия, выдерживают s течение 1 ч, нейтрализуют действие периодата калия добавлением 2Х-ного оаствора глюкозы.

Пример, Культуру сальмоиелл выращивают в четвертях С 2,5X-ma< агаром (МПА) 18 ч. Бактерийиую массу с каждой четверти. смывают 10 мл физиологического раствора. Чистоту культуры контролируют бактериоскопическим исследованием. Бактерийную массу дважды отмывают физиологическим раствором при 5000 об/мин, переносят в колбу и заливают при перемешивании 400 мл (на 2 г клеток, влажный вес} воды, предварительно нагретой на водяной бане до 65-68 С.

Суспензню интенсивно перемешивают, прибавляют 400 мл 90Х-ного фенола (65-68 С) и смесь выдерживают 200

1084293 2

25 мин при 68о(".. (Израэонаншуюся эмульсию охлажцают сначал» при комнатной температуре до 25 С, а затем

1-2 ч в холодильнике до 4-5 C. После этого смесь центрифугируют 30 мин (1000 об/мин), смесь разделяется на три слоя: верхний — водный, содержащий липополисахарид и нуклеиновые кислоты, промежуточный — фенольный, содержащий белок, и нижний, содержащий остатки разрушенных клеток и крупномолекулярный белок. Водный слой отделяют с помощью сифона и диализу1от 48 ч против проточной

15. воды (10 С), далее лиофилизируют.

Для разрушения 0,12 антигена в липополисахариде готовят 5 мл

0,5-1Х-ного раствора липополисахарида в NaC2"буфере, рН 7,1, сливают

20 в равных объемах раствор липополисахарида и 0,00015 М раствор перйодата калия в NaCf-буфере, выдерживают

1 ч, добавляют несколько (5) капель

2Х-ного раствора глюкозы. Через

25 10 мин раствор антигена используют для посадки на эритроциты в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

В табл. 1 приведены сравнительные результаты РНГА с липополисахаридами

30 (ЛПС) до и после обработки раствором перйодата калия.

В табл. 1 приведены сравнительные результаты постановки РНГА с липополисахаридами из S.essen H S.upsala до и после удаления антигена 012 и с сыворотками к сальмонеллам с различным набором антигенов. Предлагаемый способ обеспечивает возможность полного разрушения антигена 012, что подтверждается отрицательными результатами РНГА с липополисахаридами без антигена при наличии высоких титров реакции с липополисахаридом, полученным известным способом. Обработка ЛИС раствором перйодата калия не влияет на антиген 04; при постановке РНГА с сыворотками к .

S.paratyphi В, S.essen H S.upsala не отмечено разницы в титрах до и после обработки раствором перйодата калия.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить специфичность липополисахаридного антигена сальмонелл группы В. Предлагаемый способ обеспечивает возможность полного разрушения антигена 012 при сохранении

1084293

Постановка РНГА с диагностикумом

0-4, специфичным для группы В сальмонелл, позволяет при выпадении отрицательной пробы говорить об отсутствии антител к сальмонеллам группы В. В силу высокой специфичности диагностикума он может при25

Таблица 1

Сыворотки"

Сальион еллы, использованные для получения ЛПС

Титры сывороток в РНГА с ЛПС, приготовленным способом известным предлага- емым

S.åssån (О 4,12) 1: 12600 1: 12600

S.essen (О 4,12) S.paratyphi А (О 1,2,12) 1:400

Отр. (О 9,12) S.typhi

1: 640

1: 51200

Отр.

S.paratyphi В (О 1,4,5,12) 1:512(0.

1:25600

S.upsala (О 4,5,12) (О 4,5,12) (О 9,12) 1:25600

1: 51200

S.upsala

S.typhi

Отр.

М

Использовали сухие неадсорбированные агглютинирующие сыворотки производства Ташкентского НИИВС. аптигLía 04, специфичного для группы В сальмонелл.

В табл. 2 приведены средние геометрические титры у обследованных групп. 5

Ив табл. 2 видно, что активность

1 диагностикума 0-4 не уступает активности диагностикума 0-1, 4,12 (коммерческий диагностикум, Москва,.

НИИЭМ им.Г.Н.Габричевского), о чем свидетельствуют примерно равные . титры РНГА с указанными препаратами, полученные у больных сальмонеллезами группы В. Значительно более низкие . титры РНГА с диагностикумом 0-4 по сравнению с коммерческим диагностикумом. 0-1, 4, 12, полученные при обследовании доноров, свидетельствуют о более высокой специфичности диагностикума 0-4. 20 меняться в сомнительных случаях для дополнительной диагностики сальмонеллов группы В. Это позволяет повысить эффективность серологического типирования группы В сальмонелл, что в свою очередь йовышает эффективность лабораторной диагностики заболеваний.

Способ разработан и внедрен в лаборатории специфической индикации возбудителей инфекционных заболеваний Горьковского НИИ эпидемиологии и микробилогии.

В настоящее время этиологическим фактором подавляющего числа сальмонеллезов на территории СССР являются сальмонеллы группы В. При постановке серологического диагноза у больных сальмонеллезами обычно используется набор сальмонеллезных диагностикумов к группам А, В, С, D и др. За счет общих антигенов наблюдаются выраженные перекрестные реакции у групп А, В и 9 что не всегда позволяет правильно оценить реакцию и, следовательно поставить диагноз, особенно, если нет бактериологичес"кого подтверждения.

S дован1084293

Таблица 2

Среднегеометрические титры

Группа обследованных

Диагностикум

0-1,4, 12

Диагностикум о-4

Больные паратифом "В" и прочими сальмонеллезами группы В

1:208

104

1: 260

1:24

1:4

101

Доноры

Заказ 1926/19 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", .г, Ужгород, ул. Проектная, 4!

Составитель П. Бонарцев

Редактор Т. Веселова Техред А.Бабинец . Корректор А. Тяско