Способ получения комплекса внеклеточных ферментов

Патент 1084299

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

,VCnOCOB ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА ;ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий культивирование продуцентовгрибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода , минеральные соли и воду с последуннцим отделением грибного мицелря от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, о т л ичающийся тем, что, с целью повьшения активности комплекса, а также упрощения и удешевления способа , в качестве источника углерода используют агримус - отход производства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в соотношении 42:1, в количестве 0,55 ,0%. 2.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что, с целью получения преимущественно фермента пероксидазы , культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5%. 3.Способ по пп. 1 и 2, о т л ичающийся тем, что, с целью (Л получения преимущественно фермента t монофенол-монооксигеназы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 4,05 ,0%.

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР (21) 3520061/28-13 (22) 08.12.82 (46) 07.04.84. Бюл, к- 13 (72) В.Д.Семичаевский, Н.И.Даниляк и И.А.Трутнева (71-) Институт ботаники им.Н.Г.Холодного (53) 579.6.15(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР .

h> 654679, кл. С 12 N 1/16, 1979.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 747886, кл. С 12 Н 1/00. 1980. (54)(57) } СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОКШЕКСА ,ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРИЕНТОВ, предусматривающий культивирование продуцентовгрибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицелия от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные ферменты, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью дц С 12 N 9/02, С 12 N 1/14,: повышения активности комплекса, а также упрощения и удешевления способа, в качестве источника углерода используют агримус вЂ” отход производства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в соотношении 42: 1, в количестве 0 55,0%.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю- шийся тем, что, с целью получения преимущественно фермента пероксидазы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5Х.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью получения преимущественно фермента монофенол-монооксигеназы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 4,05,07.

1084299 2 соотношении 42:1, в количестве 0 55,0Х.

Кроме того, с целью получения преимущественно фермента пероксидазы культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 1,0-2,5Х.

С целью получения преимущественно фермента монофенол-монооксигеназы, культивирование проводят путем образования поверхностной пленки при использовании агримуса в концентрации 4,0-5,0 .

Агримус представляет собой многотоннажный отход, полученный при производстве фурфурола из стержней початков кукурузы, который частично используют как лигноцеллюлозное удобрение в сельском хозяйстве.

Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава

И Н4НгР04 2,0

КН Р04 0,6

К 2НР04 0,4 м яо4 0,5

Агримус 5,0

Водопроводная вода 1 л.

Приготовленную таким образом среду автоклавируют, охлаждают и засевают чистыми культурами базидиомицетов

Pfeurotus ostreatus (Fr.) Kumm. HNBF1300.или Coriogus versicolor (Fr.)

Quet.087. Культивирование проводят в глубинных условиях на качалке ,в колбах Эрленмейера в течение 7 сут. п ри 28 С.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения ферментов, продуцируемых базидиомицетами. 5

Известен способ культивирования базидиомицетов на питательной среде, содержащей источник углерода и минеральные соли, а также отходы производства j1) .

1О

Однако данный способ не позволяет получить широкий спектр продуцируемых ферментов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту 15 к предлагаемому является способ получения комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающий культи вирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, 20 содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицелия от культуральной жидкости, содержащего вне" 25 клеточные ферменты (2) .

К недостаткам этого способа относятся сложность технологии его. осуществления и значительные затраты времени и средств. Кроме того, способЗО ограничивается использованием единственного штамма дереворазрушающего гриба. В нем использован недостаточно широкий ассортимент лигнинсодержащих отходов и получаемых при этом продуктов биосинтеза микроорганизмов, в частности внеклеточных ферментов, обладающих недостаточно высокой активностью.

Цель изобретения вЂ” повышение 4

О активности комплекса ферментов, а также упрощение и удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения 45 комплекса внеклеточных ферментов, предусматривающему культивирование продуцентов-грибов базидиомицетов на питательной среде, содержащей лигнинсодержащие отходы в качестве 5О источника углерода, минеральные соли и воду с последующим отделением грибного мицелия от культуральной жидкости, содержащей внеклеточные фер/ менты, в качестве источника угле" 55 рода используют агримус-отход производства фурфурола, содержащий целлолигнин и свободный фурфурол в

Для сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидиомицетов проводят также в аналогичных условиях на питательной среде, содержащей вместо агримуса целлюлозу (фильтровальную.бумагу) в количестве

15 0 г/л.

В табл. 1 и 2 приведены результаты измерений активностей внеклеточных пероксидазы (КФ 1.11.1.7), монофенол-монооксигеназы (КФ 1. 14.

18. 1), Эндо-1,4-P-глюканаэы (КФ.3.2.

1.4), полигалактуроназы (КФ 3.1.1.15), экзополигалактуроназы (КФ 3.2.1.67) и пектинэстеразы (КФ 3.1111) в культуральных фильтратах указанных продуцентов, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата. По сравнению с контролем среда с агримусом более эффективна для получения большинства з 1.084299 исследуемых ферментов. Так, при выращивании Р2еигойиз ostreatus на среде с агримусом достигнуто увеличение активности пероксидаэы и монофенол-монооксигеназы, более чем в

12 раз по сравнению с контролем.

П р и.м е р 2. Готовят питательную среду по примеру 1, которую засевают чистыми культурами базидиомицетов PPeurotus ostreatus (Гг.) 10

Kumm. HMBF-1300, FunaIia trogii (Berk.) Bond et. Sing БИН-2 или

0xyporus obducens (Fr.) Donk.ÈÁÊ-85.

В отличие от примера 1 культивирование проводят в стационарных условиях методом поверхностной пленки в течение 10 сут при 28 С. о

Для сравнения в качестве контроля выращивание указанных базидиомицетов проводят также в аналогичных 2р условиях на питательных средах, содержащих вместо агримуса целлюлозу (фильтровальную бумагу) в количестве.

15 0 г/л или экстракт из свекловичного жома в количестве 100 мл/л. 2

В табл. 3 приведены результаты измерений активностей внеклеточных пероксидазы и монофенол-моноксигена-зы в культуральных фильтратах укаэанных продуцентов, полученных после ЗО отделения -мицелия и остатков твердого субстрата. На среде с агрнмусом активность обоих ферментов згачительио вышее, чем в контрольном варианте.

Так, для культуры Pfeurotus ostrea35

tus активность пероксидазы на среде с агримусом составляет 18,6 ед/л, тогда как в контроле с целлюлозой обнаружены следы активности этого фермента, на среде с экстрактом из свекловичного жома активность пероксидазы составляет 14,2 ед/л.

П р и м е .р 3. Готовят питательную среду по примеру 1, в которую в качестве единственного источника углерода вводят агримус в количествах 5,0-50,0 г/л. Указанные среды засевают чистой культурой базидиомицета PIeurotus ostreatus (Fr.) Kumm.

HMBF-1300. Культивирование проводят в стационарных условиях методом поверхностной пленки в течение

10 сут при 28 С. В табл. 4 приведены результаты измерений активностей внеклеточной пероксидазы и монофенолмонооксигеназы- в культуральных фильтратах, полученных после отделения мицелия и остатков твердого субстрата.

Из табл, 4 видно, что наибольшая активность пероксидазы культуры гриба Pleurotus ostreatus вЂ” 56,2 ед/л при концентрации агримуса 1 0Х а наибольшая активность монофенол-монооксигеназы вЂ” 56,0 ед/л при концентрации агримуса в среде 4,0Х.

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить активность ферментов получаемого комплекса в 12 раз, а также упростить и удешевить способ за счет использования отхбдов производства.

Ед/изм

Вариант . X активности с целлю- по отношению лозой к контролю) (контроль}

Субстрат

Вариант с агримусом

Фермент

1244 ед/л

0,9

Бензидин

Пероксидаза

Монофенолмонооксигенаэа

1285

0,7

9,0

Бензидин

Эндо-1,4-Рглюканаза

7 деполимеризации

Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы

203,5

19,9

40,5

Таблица 1

Активность внеклеточных ферментов Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm

ИМВР-1300 при глубинном выращивании на агримусе и целлюлозе

1084299

Продолжение табл. 1

Пектин

Полигалактуроназа свекловичный ед/мл 33, 3

43 5

76,6

ЭкзополиПектовая кислота

0,513

100,0 галак туро" наза

Пектинэстераэа

Пектин высокометоксилированный

0,10

200,0

0,20

Таблица 2 !

Активность внеклеточных Ферментов Coriolus versicoPor (Fr.) puef

087 при глубинном выращивании на агримусе и целлюлозе

Вариант Ж активности с целлю- по отношению лозой к контролю (контроль

Субстрат

Фермент ед/л

2,2

159, 1

3,5

Пероксидаза

Монофенолмонооксиге173,7 l,9

3,3 наза

Эндо-1,4-Р глюканаза

72,0

89,4

Нолигалактуроназа ед/мл 500,0

65,0

769,2

Пектовая кислота

Экзополигалактуроназа еду(мл О, 82

Следы

Пектин.

Пектинэстераза ед/мл 0,05 высокометоксилированный

125,0

0,04

Бензидин

Бенэидин

Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы

Пектин свекловичный

Ед/изм Вариант с агримусом

Ед.изм. Вариант с агримусом

Ж деполимериэации 64,4

Вариант с целлюлозой (контроль) Х активности по отноиюнюв к контролю) 10 34299

Таблица 3

Активность внеклеточных ферментов базидиомицетов при выращивании методом поверхностной пленки на агримусе, целлюлозе и экстракте и з жома

Фермент

Субстрат

Ед.изм.

P7eurotus ostreatus (Fr.) Kumm

Перексидаза Бенэидин ед!л 18,6

HMBP-1 300

Следы

14,2

Монофенолмонооксиге18,0 Следы

13,0 наэа

FunaIia trogii (Berk) Bond. et. Sing БИН- 2

14,0

Следы

8,0

Пероксидаза

3,9

10,0

Следы

0xyporus olducens (Pr.) Donk ИБК-85

6,0

14,6

Пероксидаза

Следы

5 0

Следы

Таблица 4

Активность внеклеточных ферментов Pleurotus ostreatus (Fr) Kumm

HMBF-1300 при выращивании методом поверхностной пленки в зависимости от содержания агримуса в питательной среде

Ед.изм. Содержание агримуса (вес.7) Субстрат

Фермент

0,5 1,0 2,5 4,0 5,0 ед/л 18,6 56,2 42,2 46,4 28,0 ю

Пероксидаза Бензидин

Монофенолмонооксиге17s5 20,0 40,0 56 0 31 0 каза

ВЯИИПИ Заказ 1926/19 Тираж 522 Подписное

1® 1иал ППП "Пэтеат", г. Ужгород,ул.Проектная, 4

Монофенолмонооксигеназа

Вариант с агримусом

Вариант с целлюлозой (контроль) Вариант экстракт из, свекловичного жома