Способ определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях

Способ определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

спех:ов ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой с последующим воздействием на исследуекш1й материал тиоцианатом аммония и спектрофотометрией, о т л и ч a ющ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа, предварительно проводят экстракцию липидов этанолом в соотношении Cl3:l)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

09) Ol) 3(59 0 01 ." 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3468369/28-13 .(22) 08.07.82 (46) 07.04.84. Бюл. 9 13 (72) В.В.Мирончик (71) Белорусский научно-исследовательский институт кардиалогии (53) 616.07(088.8) (56) 1. Владимиров Ю.В., Арганов А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М

1972, с.252.

2. Воскресенский О.Н., Витт В.В.

В кн. — "Биоантиокислители". М., 1975, с.227-229 °

3. Романова Л.A., Стальная И.Д.

В кн.-"Современные методы в биохимии"..М, 1977, с.64-66 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕИ ЛИПИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЯХ путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой с последующим воздействием на исследуемый материал тиоцианатом аммония и спектрофотометрией, о т л и ч а юш и и с я тем, что, с целью повышения .чувствительности способа, предварительно проводят экстракцию липидов этанолом в соотношении (13:1) (16:1) к исследуемому материалу .с; последукицим встряхиванием смеси в течение 5-6 мин.

1084681

Изобретение относится к медицине, точнее к биохимическим исследованиям, способа требует сложного биохимического оборудования, а именно наличия электронных полярографов (типа LP-60, L Р-7, L Р-7Е),специальных герметических электролизеров с приспособлением для продувки аргонбм и т.д.

Известен способ определения гидроперекисей липидов в биологических тканях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой и последующим воздействием на исследуемый материал растворами соляной кислоты, соли

Мора, тиоцианата аммония и спектрофотометрическим измерением продуктов реакции P3) .

Однако данный способ является недостаточно чувствительным.

В ходе осуществления способа взаимодействие реактивов происходит с заниженным количеством гидроперекисей липидов, так как добавление к биологическому материалу трихлоруксусной кислоты с конечной концентрацией в растворе 5% приводит к осаждению не только белка, но и липидов, входящих в состав липопротеидных комплексов.

Отсутствие в способе единого объекта (экстракта липидов) для одновременного определения липидов и их гидроперекисей делает невозможным исследования достоверного соотношения липидов и их гидроперекисей (содержание гидроперекисей в единице липидов), что является основным показателем гидроперекисей липидов. Это связано с влиянием погрешностей двух методик на конечный результат, когда вместо очищенного липидного экстракта (объекта исследования) берут цельную биологическую ткань.

Кроме того, использование известного способа требует большого количества исследуемого биологического материала (2,0 мл).

Приведенные недостатки снижают воэможность применения известного способа как для дифференциальной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний, так и в биохимических экспериментальных исследованиях.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа. и может быть использовано дри определении содержания гидроперекисей лиидов в различных биологических тканях.

Свободнорадикальное, перекисное окисление липидов тканей играет важную роль в регуляции нормальных метаболических процессов и в механизме развития целого ряда патологических 10 состояний.

Для получения полного представления о кинетике перекисного окисления липидов в тканях животных и человека определяют фракции перекисей липидов в зависимости от этапов их образования — диеновую коньюгацию ненасыщен15 ных высших жирных кислот, появляющуюся на начальных этапах липопереокислейия, гидроперекиси липидов, обнаруживаемых на более поздних этапах перекисного окисления липидов и, наконец, малоновый диальдегид — один иэ наиболее важных конечных продуктов перекисного окисления липидов (1).25

Известен способ определения гидроперекисей липидов путем прямого гистохроматографического определения в животных тканях f2) .

Однако известный способ, несмотря на более высокую чувствительность, остается трудоемким (приготовление срезов тканей на замораживающем микротоме, нанесение образцов на пластины, экстракция и разделение перекисей липидов в специальной герметичной камере с углекислотой .в постоянном восходящем потоке растворителя и т.д j и очень длительным по выполнению (определение у 2-х животных

4 образца тканей, 8-10 пластин занимает световой день) .

Однако данный способ, несмотря на меньшую длительность его осуществле ния по сравнению с предыдущими способами, является .сложным и трудоемким. Точность способа зависит от предварительной экстракции липидов из биологического материала и от качества препаративного их разделения ° Поэтому способ может быть использован в специальных научных исследованиях, цель которых идентификация фракционйовФ состава продуктов перекисного Окисления полиненасыщенных жирных кислот.:Реализация

Поставленная цель достигается согласно способу определения содержания гидроперекисей липидов в биологических тканях путем осаждения белка трихлоруксусной кислотой о последующим воздействием на исследуемый материал тиоцианатом аммония и спектрофотометрией, при котором предварительно проводят экстракцию липидов этанолом в соотношении (13:1)(16:1) к исследуемому материалу с последующим встряхиванием смеси в течение 5-6 мин.

60

Способ может быть использован только для специальных научных исследований, когда идентификацию гидроперекисей липидов требуется определить in 45

vivo. о

Известен способ определения гидроперекисей липидов методом полярографической регистрации, основанной на выявлении характеристики потенциала полуволны липоперекисей по поляризационным кривым сила тока — потенциал.

1084681

Способ осуществляют следующим образом.

Забор ткани и приготовление образцов для экстрагирования проводят при температуре с 4 С. 0,2 мл плазмы крови, содержащей 0,5 мг/мл оксалат

5 натрия или другого биологического материала в буферном растворе с рН=

7,4 (тканевой гомогенат нли митохондриальная фракция с концентрацией белка 10-16 мг на пробу), помещают в центрифужную пробирку с хорошо фиксируемой пробкой, добавляют 2,8 мл этанола и 0,05 мл 50%-ного раствора

ТХУ. Закрывают пробирку пробкой и интенсивно встряхивают в течение 15

5-6 мин. Образующийся белковый осадок отделяют центрифугированием (10 мин при 3000 об/мин) .

Полученный супернатант, представляющий собой этанольный экстракт ли- 2щ пидов, используют как объект для определения гидроперекисей липидов и общих липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты.

Гидроперекиси липидов определяют следующим образом. 1;5 мл этанольного экстракта доводят зтанолом до

2,7 мл, встряхивают и добавляют

0,02 мл концентрированной НС8 и

0,03 мл 1%-ного. раствора соли Мора в 3%-ом растворе НС . Интенсивно встряхивают и точно через 30 с приливают 0,2 мл 20%-ного раствора тиоцианата аммония, после чего развивается малиновая окраска. Измерение

Оптической плотности производят в 35 течение 10 мин после добавления тиоцианата аммония на серийном спектрофотометре при длине волны 480 нм (ход с луча в кювете 10 мм). Контрольную пробу ставят как опытную, 40 .но вместо плазмы крови берут 0,2 мл

Н О bidest. Величина а Д4%р, обусловленная содержанием гидроперекисей липидов, равна разности между значениями Д4%р ОпытнОЙ и кОнтрольнОЙ 45 пРоб. д Длв0 (гндРопеРекиси липидов) =

Д4 (onHT) -Дль0 (контроль)..

Общие липиды определяют следующим образом. 0,75 мл оставшегося супернатанта выпаривают на водяной бане, и добавляют к осадку 2,5 мл концентрированной Н1604 . Тщательно переме:,шивают содержимое и помещают в кипящую баню на 10 мин. После охлажде- ния под водопроводной водой к 0,4 мл отобранной смеси добавляют 2,8 мл фосфатно-ванилинового реактива (4 ч. концентрированной Н РО» смешивают с 1 ч. 0,6%-ного раствора ванилина), тщательно перемешивают и оставляют на 45 мин при комнатной температуре. (Экстинкцию измеряют иа фотоэлектрокалориметре при зеленом светофильтре (длина волны 500-560 нм) в кювете с толщиной слоя 5 мм против, контрольной пробы. 65

При использовании спектрофотометра измерение проводят при длине волны

530 нм. В контроле вместо этанольного экстракта берут этанол. Расчет производят по калибровочному графику или пб стандарту, в качестве которого используют троолеин.

Содержание гидроперекисей липидов в биологическом материале выражают в величинах оптической плотности при 430 нм на 1 мл плазмы крови (дД48р /мл плазмы) или на 1 r ткани (ь Д 48о /г ткани), а также на 1 мг лиПидОВ (Д Д4 р /Мг ЛИПИдОВ)

Пример 1. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у здорового мужчины К., 30 лет. Гидроперекиси липидов 0,265 (gД4%р /мл плазмы) и 0,056 (А Д4 р /мг липидов) . Общие липиды 4,70 г/л.

Пример 2. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у больного Ш., мужчины, 55 лет. Диагноз: ИБС. Стенокардия напряжения и покоя. Атеросклеротический кардиосклероз с блокадой левой ножки пучка Гиса. Атеросклероз аорты, коронарных артерий. Нр . Гидроперекиси липидов 0,352 (6 Д48е/мл плазмы) и 0,057 (g Д4 /мг липидов). Общие липиды 5,23 г/л.

Пример 3. Определено содержание гидроперекисей липидов в плазме крови у больного В., мужчины;

53 лет. Диагноз: ИБС. Острый период трансмурального передке-верхушечного инфаркта миокарда левого желудочка с вовлечением боковой стенки. Атеросклероз аорты, коронарных артерий.

Н,. Гидроперекиси липидов 0,416 (Д48р /мл плазмы) и О, 060 (ь Длэр /мг липидов) . Общие липиды 6,92 г/л.

Всего обследовано 20 здоровых мужчин в возрасте от 26 до 50 лет, 32 больных ишемической болезнью сердца, мужчины в возрасте от 29 до

62 лет и 29 больных в остром периоде инфаркта миокарда, мужчины в возрасте 38-60 лет. !

Результаты исследования представлены в таблице 1.

Пример 4. Исследована динамика содержания гидроперекисей липидов в интактной митохондриальной фракции и фракции митохондрий, инкубированной при 37рС в присутствии 0 „1 мМ .Ре$04, что приводило к интенсификации перекисного окисления липидов в начале инкубации, а через 10 мин к его торможению.

Результаты исследований приведены в табл. 2.

Этанол действует как детергент и как экстрагирующий органический растворитель. Присутствие в этаноле трихлоруксусной кислоты способствует усилению разрыва липид — белкОвых

1084681

Таблица1

Инфаркт миокарда, острый период (29 чел.) Ишемическая болезнь сердца (32 чел.).

Здоровые (,20 чел.) Показатели

Гидроперекиси лип идов (Д4 /мл пл.) 0,270+0,016

0,345+0,028

0,405+0,025

Гидроперекиси липидов (ф Д 0 /мг лип.) 0,058+0,004

0,068+0,004

0,057+0,003

Общие липиды, г/л

5 12+0 20

6,85+0,20

4у74+0,18

Таблица2

Пробы (2 J 3 4

Показатели

1 5

Время инкубации при 37 С в присуто ствии 0 у 1 мИ Рь ЯО р мин Ф

Д4

10 15

0 5

0 038 0 098 0 151 0 101 0 066

4.

Величины представляют собой среднее арифметическое пяти параллельных опытов. связей, что увеличивает степень экстракции гидроперекисей липидов.

Результаты опытОв приведены в табл. 3.

Встряхиванием смеси биологического материала этанола и трихлоруксус- 5 ной кислоты (ТХУ) в течение 5 мин и более приводит к максимальной экстракции гидроперекисей липидов.

В табл. 4 приведена зависимость экстракции гидроперекисей липидов IO от времени.

Наличие нелипидных примесей в этанольном экстракте, таких как сахара и аминокислоты, не мешает определению содержания гидроперекисей 15 липидов, так как они вступают в реакцию с солями металлов преимущественно при смещении рН в щелочную сторону.

Проведена этанольная экстракция растворов глюкозы в воде с концентрациями 60,600 мг Ъ аминокислот цистеина и триптофана с концентрациями

2,20,200 мгЪ предлагаемым способом.

После добавления растворов соляной кислоты, соли Кора и тиоцнаната ам- . мония оптическая плотность ДЕо по сравнению с контролем была равна нулю. Следовательно, даже увеличение содержания глюкозы и аминокислот в биологических тканях на один или два порядка не отражается .на определении гндроперекисей в липндных экстрактах, получаемых по предлагаемому способу.

Таким образом, в предлагаемом способе определения гидроперекисей липндов в биологических тканях чувствительность по сравнению с прототипом возрасла на 42-49% (табл. 3).

Способ позволяет более точно определить соотношение гидроперекисей и общих липидов, требует меньшего объема исследуемого биологического материала (в 5-10 раз) .

Предлагаемый способ обеспечнвает

Высокую чувствительность, хорошую воспроиэводимость, а также быстр и прост в осуществлении.

1084681

Таблица 3

Пробы

Показатели

Д Л е l этанол)

Й1 ñ

Д Д4 (T )

131 130

137 133

134

Т а б л и ц а 4

Время экстрагирования, мин

Составитель С.Котелевцев

Техред А. Вабинец

Редактор С.Юско

Корректор Г.Решатник

Заказ 1988/38 Тирам 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r,.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4, h Д (ТХУ) (прототип)

g Д4 (этанол)

Д Д <>о (этанол+ТХУ ) Д 4So (этанол+ТХУ)

Ъ дД44, 0,190 . 0,175 0,180 0,195 р,2р4

0,255 0,240 0,240 0,245 0,265

0,270 0,255 0,265 0,290 0,295

142 146 147 149 145

Пробы (1 Г ) 1 2 3 4 5

0,235 0,220 0,234 0,215 0,240

0,260 0,285 0,275 0,275 0,280

0,265 0,285 0,270 0,275 0,280