Питательная среда для выращивания туляремийного микроба

Питательная среда для выращивания туляремийного микроба

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, содержащая белковую основу, L-цистеин, глюкозу, стимуляторы роста, минеральные соли, агар и воду, отличаю а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба , она в качестве белковой основы содержит фосфорнокислотный гидролизат водонерастворимого остатка плазмолизированных парафинокиспяющих дрожжей, в качестве стимуляторов роста содержит экстракт плазмолизирован- ,ных парафинокисляющих дрожжей, цит;рат. натрия- 5,5 , пиридоксин гидрохлорид и ЭДТА-динатриеву$о соль, в качестве минеральных солей - сульфит натрия , калий фосфорнокислый двузамещенныйI калий углекислый, железо сернокислое закисноё семиводное и магний сернокисльй при следз щем количественном соотношении компонентов , г/л: Фосфорнокислотный гидролизат водонерастворимого хзстатка плазмолизированных парафинокисляющнх дрожжей115-30 L-цистеин0,4-1,2 Глюкоза10-30 (Л Экстракт плазмолизированных парффинокислякяцих дрожжей- 5-10 Цитрат натрия-5, 0,5-2 Пиридоксин гидрохлорид 0,005-0,02 ЭДТА - динатриевая соль 0,02-0,1 Сульфит натрия0,4-1 фосфорнокислый двузамещенный2-т6 Калий углекислый 0,5-1,5 Железо сернокислое закисное семиводное 0,5-0,2 Магний сернокислый 0,025-0,1 Агар10-11 ВодаДо 1 л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

i 15-30

0,4-1 2

10-30

0,5-0;2

0,025-0,1 f0-11

До1л

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3380925/28-13 (22) 11.01.82 (46) 15.01.89. Бюл. Я 2 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский проти». вочумный институт (72) В.В.Сухарь, В.Н.Милютин, В.А.Копылов и Н.Л.Кириллова (53) 576.8.093.1(088.8) (56) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. N.Î.Áèðãåðà, М,, Медицина, 1982, с. 81.

Кундин В.А. Прозрачная питательная среда для Fr. Tularensis. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1969, и 4, с. 34-36.

1 (54)(57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВНРАЩИВАНИЯ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА, содержащая белковую основу, L-цистеин, глюкозу, стимуляторы роста, минеральные соли, агар и воду, о .т л и -. ч а ю щ а я с я тем, что, с целью повышения чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба, она в качестве белковой основы содержит фосфорнокислотный гидроли-. зат водонерастворимого остатка плаэмолизированных парафинокисляющих дрожжей, в качестве стимуляторов роста содержит экстракт плазмолиэирован„,SUÄÄ 1085230 А цр 4 С 12 N 1/20 //С t2 ч 1/04,ных парафинокисляющих дрожжей, цитрат, натрия 5,5 Н О, пиридоксин гидро" хлорид и ЭДТА-динатриевую соль, в качестве минеральных солей - сульфитнатрия, калий фосфорнокислый двуэа- мещенный, калий углекислый, железо сернокислое закисное семиводное и г магний сернокислый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Фосфорнокислотный гидролнзат водонерастворимого -остатка плазмолизированных парафинокисляющих дрожжей

L-цистеин

Глюкоза

Экстракт плазмолизированных парефинокисляющих дрожжей . 5-1 О.

Цитрат натрия 5,5 F. О 0 5-2

Пиридоксин гидрохлорид 0,005-0,02

ЭДТА - динатриевая соль 0,02-0> 1

Сульфит натрия О, 4-1

КаЛий фосфорнокислый двузамещенный 2-,6

Калий углекислый 0,5-1,5

Железо сернокислое за. кисное семиводное

Магний сернокислый

Агар

Вода

1085230

1 i

Изобретение относится к микробиологии и касается питательной среды для выращивания туляремийного микроба.

Известна питательная среда для выращивания туляремийного микроба, содержащая гидролизат свежей рыбы, гидролизат желатина, аутолизат дрожжей, натрий хлорид, глюкозу, цистин, 10 агар-агар, дефибринированную кровь кролика в воду.

Известна также питательная среда для выращивания туляремийного микроба, содержащая белковую основупанкреатический гидролизат кильки,L цистеин, глюкозу, стимуляторы роста экд, раствор черного альбумина, минеральные соли " NaC1, КН<РО<, К НРО, активированный уголь, агар и воду.

Однако известные питательные среды не обеспечивают высокой чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба и для повышения ростовых качеств среды необходима предварительная активация культуры.

Целью изобретения является повышение чувствительности среды и ускорения роста туляремийного микроба.

Эта цель достигается тем, что пи3 тательная среда для выращивания .туляремийного микроба, содержащая белковую основу, L-цистеин, глюкозу, стимуляторы роста, минеральные соли, агар и воду, в качестве белковой ос- 3 новый содержит фосфорнокислотный гидролизат водонерастворимого остатка плазмолиэированных парафинокисляющнх дрожжей, в качестве стимуляторов роста содержит экстракт плазмолизиро» . ванных парафинокисляющих дрожжей, цитрат натрия ° 5,5 Н О, лиридоксин„ гидрохлорид и ЭДТА — динатриевую соль, в качестве минеральных солей— сульфит натрия, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий углекислый, железо сернокислое закисное семиводное ,и магний сернокислый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Парафинокисляющие плаэмолизированные дрожжи заливают 100 л водопроводной воды, перемешивают 10 мин и от5 стаивают 90 мин. Надосадочную жид-, кость (экстракт) декантируют и упаривают в пищеварочном котле в 4 раза (до 5"6% концентрации сухих веществ), и добавляют, перемешивая, 70 г

К НРО, рН доводят до 6,8, нагревают до кипения и фильтруют через фильтр

° Сальникова с бельтингом и фильтровальной бумагой, а,затем высушивают на распылительной сушке при 160 С на о входе и 90 С на выходе.

Неплотный осадок др ожжей, оставшийся после декантации экстракта, центрифугируют на проточной сепара- ; торной центрифуге, осадок (водоне растворимую часть плазмолиэированных дрожжей) суспендируют .в 120 л воды, заливают по 60 л в автоклавы ВК-75.

Помешивая, добавляют ортофосфорную кислоту до концентрации 2Х и ведут гидролиз в течение 90 мин при 1,5 атм.

После охлаждения до 90 С рН гидролизата доводят до 4,3-4,5 добавляя

Са(ОН) .

Гидролизат оставляют на ночь, надосадочную жидкость декантируют, а осадок центрифугируют. Центрифугат смешивают с декантантом и к смеси до бавляют Са(ОН) до рН 9,2. Образовавшийся преципитат отделяют фильтрацией

5 через фильтр Сальникова с бельтингом и фильтровальной бумагой. К фильтрату добавляют соляную: кислоту до рН 6 и сушат распыпительной сушкой (160 С на входе, 80 С,на выходе).

15-30

0,4-.1 ° 2

10-30

Фосфорнокислотный, гидролиэат водонерастворимо го остатка плаэмолизированных парафинокисляющих дрожжей

L-цистеин

Глюкоза

Экстракт плазмолиэированных парафинокисляющих дрожжей 0 5-2

Цитрат натрия ° 5,5 Н О 0 5-2

Пиридоксин гидрохлорид 0,005-0 02 .

ЭДТА-динатриевая соль 0,02-0, 1

Сульфат натрия О, 4-1

Калий фосфорнокислый двуэамещенный 2-6

Калий углекислый 0,5-1,5

Железо.сернокислое эакисное семиводное . 0 05-0,2

Магний сернокислый 0,025-0, 1

Агар 10-11

Вода До1л

Приготовление и использование. пита. тельной среды иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. з 10852

15 r дрожжевого гидролизата раст воряют в 0,5 л дистиллированной воды, добавляют 5,6 r угля "Б-кислый", перемешивают в течение 1 ч уголь отФ

5 деляют фильтрованием через 2 слоя фильтровальной бумаги, К раствору гидролизата добавляют одномоментно при перемешивании 5 r дрожжевого экстракта, 10 г глюкозы, 0 4 r L-цистеина солянокислого, 0,5 r цитрата натрия 5,5 Н О, 0,02 г ЭДТА-динатриевой соли, 2 r К НРО, 0,05 г FeSO4 х х 7 Н О, 0,025 r MgSO, 0,005 r пири,доксина гидрохлорида, 0,05 r К СО, перемешивают до растворения. Добавля," ют воду до 1 л КОН до рН 7 и агарпорошок 10 г. Через 20 мин среду варят до расплавления агара охлаждао ют до 45 С, добавляют, перемешивая» 20

0,4 r сульфита натрия в 10 мл воды.

Если нежелательно стерилизовать среду, добавляют антибиотики (натриевую соль ампициллина и полимиксина М . сульфата 50 и 100 мг соответствен- 25 но) в 5 мл воды.

Агар разливают в чашки и подсушивают до удаления конденсата.

При посеве культуры Fr. tularinsis . 9 15 в количестве 100 м.кл. выросло 30

37 «+ 2 колоний. Видимые колонии появились через 40 ч, размер 1 5-2 мм,через 3 сут.

Пример 2.

Навеску 26,05 r дрожжевого гидро35 лиэата растворяют в 0,5 л воды и сорбируют 9,84 г угля. К абсорбированному гидролизату одномоментно добавляют 8,75 r дрожжевого экстракта, 15 г глюкозы, 0,8 r L-цнстеина соля- 4р нокислого, 1 г цитрата натрия, 0,05 г

ЭДТА-динатриевой соли, 4 r К НР04, 0,1 r ГеЯО 7Н О, 0,05 MgSO+, 1 r

К СО, 0,01 r пиридоксина гидрохлорида, смесь перемешивают до растворе- 45 ния, добавляют воду 1 л, КОН до рН .7 и 10 г агара. Среду варят, охлаждают до 45 С, добавляют 0,6 r сульфита натрия, и при необходимости антибиотики, как в примере 1.

Процент прорастания вакцинного штамма Ф 15 при посеве 100 клеток составил 86 1 4. Видимые колонии появлялись на 36 ч и достигали 2 ° 5-3 мм через 3 сут.

ПримерЗ.

30, 4

30 r дрожжевого гидролизата растворяют в 0,5 л воды, добавляют 12,4 r угля. К раствору сорбированного гидролиэата добавляют дрожжевой экстракт 10 г, глюкозу 30 r. L-цистеин солянокислый 1,2 r цитрат натрия х х 5,5 Н О 2 г, MgSOy 0,1 г, пиридоксин гидрохлорид 0,02 г, К СО 1,5 г, перемешивают до растворения, доводят" рН до 7 и агар порошок 11 r. Среду варят и после охлаждения до 45 С до« бавляют сульфит натрия 1 г и антибиотики, как в примере 1.

Процент прорастания штамма В 15 при посеве 100 клеток составил 75 и

«+ 3. Видимые колонии появлялись на

40 ч и достигают 2-2,5 мм через

3 сут.

Пример4.

Навеску (70 г) сухой питательной . среды, приготовленной как в примере 2, суспендируют в 1 л дистиллиро-, ванной воды, оставляют стоять в течение 20 мин, затем добавляют 5 М

КОН до рН 7,6. Среду варят до исчезновения крупной пены и стерилизуют автоклавированием при 115 С в течение 20 мин.

В остывшую до 45 С среду добавляют 6 мл стерильного 10Х. раствора с сульфита натрия (до конечной концентрации 0,067), тщательно перемешивают и разливают в чашки. Чашки со средой подсушивают в стерильных условиях и засевают.

При посеве 100 микробных клеток процент прорастания составил 31 + 5 для вакцинного штамма Ф 15, 82 + 8 . для вирулентного штамма N- 9 и 36 + 3 для вирулентного штамма Е-261.

Пример 5.

Питательная. среда была испытана для выращивания возбудителя из объек" тов окружающей среды — трупов поле-, вок, воды открытых водоемов и др.

Данные проведенных исследований . приведены в табл. 1-2.

Использование питательной среды, позволяет повысить скорость роста возбудителя, чувствительность среды, а также упростить технологию изготовления среды, так как среду можно ис- пользовать без автоклавирования и упростить диагностику, благодаря прозрачности среды.

1085230 6

Таблица 1.

Выделение туляремийных культур нз полевого материала прямым посевом на среду АДТ (по изобретению) 1

Исследуемый материал Количество выделенных культур

Срок выделе- ния культур, сут

Вода

Отловленные грызуны

Трупы грызунов икостные останки

17 Среднеарифметический срок

Таблица2

Сравнительные данные по чувствительности к росту возбудителя на питательных средах оказатель прорастания, возбудителя туляремии, Х (посевная доза .100 м.к. ) Среда

° Ю.Tular. F.tu1lar.

F.Tular. F.Tular F.Tular.

М 15 503/840 schu E-.261

88 10 70 f 7 96 + 9 39 g 6 86 i 9 35 + 5

Предлагае" мая

89 10 60+ 7 86+ 8 .54ф 7

90 10 57+ 7 100+ 9 54+ 7

° Ю ЮЮЮ ЮВ Ю ВВ Ю11 Ю начальный рост 0,8-1,8 мм через через 24. ч 48 ч

97 9 36 5

77+ 10 44+ 6

1,2-1,8 мм через

48 ч

Известная . 67 .100

° »ВВ В ВВ « 1» ° В

ВМВЮЮЮВ ЮВ

Составитель

Техреду,МоргеитаВл Корректор M Демчик :

Редактор Н.Сильнягкна т

1.Заказ 7361 Тира:к 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиЯм при ГКНТ. СССР

113035, Иосква, .Ж-35, Рауаская наб., д. 4/5

«1

Производственно-полиграфическое предприятие, .г Уигород; ya; Проектная, 4 ерия Чувствительност среды, м.к. на 4-е на 5-е сутки сутки единич. ед.кол. кьлонии 0,2-0,5

0,1-0,2 мм мм на 4-е сутки едине кол.

0i 1-013 на 5-е на 5-е сутки .;сутки един. един. кол. КОЛ В