@ -оксиэтил-гепта(оксиэтилен)-морфолин в качестве криопротектора

@ -оксиэтил-гепта(оксиэтилен)-морфолин в качестве криопротектора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Н-Оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфол ин формулы / / Л (СН2-СН20)7 - CHj CHjO в качестве криопротектора.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1Ю (111 1511 С 07 D 295/08, А 01 N 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ "

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ Lt!, .", f

1«« ,«,««

- « i, !.« в качестве криопротектора.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГИЙ

f (21) 3575604/23-04 (22) 28.02.83 (46) 30.04.84. Бюл. Р 16 (72) Л.А. Ханина, Т.П. Линник, М.И. Шраго, Ю.В. Калугин, Е.Н. Черныш

В.С. Белоконь, П.Т. Берус и Г.Б.Герус (7 1) Институт проблем криобиологии и криомедицины АН УССР и Украинский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (53) 547.867.4.03(088.8) (56) 1. Лебедев Н.Н. Смирнова N.Ì.

О механизме кислотного катализа реакции окиси этилена с аминами.

Журнал общей химии, 1969, т. 39; с. 2732-2736.

2. Белоконь В.С. и др. Особенности митотического режима культуры клеток СПЭВ после замораживания.

"Ветеринария", 1981, Ф 6, с. 28-30., (54) N-ОКСИЭТИЛГЕПТА(ОКСИЭТИЛЕН) -МОР ФОЛИН В КАЧЕСТВЕ КРИОПРОТЕКТОРА. (57) N-Оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолин формулы

О М-(CEg-CHgO) - СН СН О

/ 1

1089090

Изобретение относится к химическому соединению, конкретно к N-оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолину формулы

О, (Сяр-СИ О} -CHgCHgO (Й используемому в качестве криопротектора, и может найти применение при низкотемпературном консервировании ядросодержащих клеток, в частности клеточных культур, выделенных из различных органов животных.

Наиболее близким по структуре к соединению формулы (f) является N-ок- 15 сиэтилморфолин формулы

/ \ о м-сн,ен он

20 который используют для изучения кинетики оксиэтилирования аминов fl) .

Известен диметилсульфоксид (ДИСО), используемый в качестве криопротектора при нйзкотемнер консервировании биологических объектов, в

Ф частности, культур клеток .)2) .

Однако ДМСО наряду с защитными свойствами (предупреждающими или ослабляющими повреждающее действие замораживания и оттаивания на клеточ- . ные культуры при их низкотемпературном консервировании) может оказывать токсическое действие на биологичес-. кие объекты. В случае проникновения его внутрь клетки возникает осмотический градиент на границе клетка— околоклеточная среда, который при переносе клетки в изоосмотические условия может оказаться причиной ги40 бели живых структур. Для предупреждения указанного повреждающего действия приходится удалять криопротектор из клеток перед переводом их в физиологическую осмотическую среду. Удаление криопротектора из клеток услож45 няет и удорожает весь процесс криоконсервирования.

Таким образом, ДИСО требует отмывания клеток после размораживания, что усложняет процесс консервирования, поскольку при отмывании необходимо соблюдать строгую асептику, и делает его дорогостоящим (применение специальных сред, занятость дополнительного, персонала). Он не эконо- мичен, поскольку применяется в относительно высоких концентрациях (до 10X). Формирование монослоя кле-. точных культур, "подвергавшихся -замораживанию под его защитой, происходит только на 4-5 сут. Он неустойчив при хранении: разлагается с образованием серосодержащих продуктов, обладающих резким неприятным запахом (сро хранения до 1 мес.).

Цель изобретения — упрощение и удешевление процесса криоконсервирования, а также повышение степени защиты биологических культур при низкотемпературном консервировании.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве криопротектора применяют соединение формулы ф .

Соединение формулы (I) получают взаимодействием морфолина с окисью этилена при 90-100 С в атмосфере

6 азота и давлении 800-1000 кПа..

П р и м= е р. 85 г (1 моль) свежеперегнанного морфолина помещают в обогреваемый реактор. из нержавеющей стали, снабженный злектромешалкой,.термопарой и устройством для дискретной подачи окиси этилена и системой охлаждения, и нагревают до

60-80 С.

В реакционную смесь медленно порциями по 5-10 мл подают 440 г (8 моль) окиси этилена, регулируя давление в пределах 800-1000 кПа.

Реакцию проводят в атмосфере азота, не допуская повышения температуры о выше 90-100 С. Реакционную смесь после подачи всей окиси этилена выдерживают 1-1,5 ч при 70-75 С, периодически продувая реактор азотом.

Очитку полученной темноокрашенной жидкости (420 r) производят путем многократной (3-5 раз) обработки разбавленного 3-4 раза водного раствора активированным углем марки .А, катионообменной смолой Ку-2-8с. Воду> и невошедший в реакцию исходный морфолин от синтезированного соединения отделяют, отгоняя их в вакууме (0,45 кПа, 27-3 1 С). Выход соединения (Х) 380 г (90X).

Продукт синтеза подвергают дальнейшему вакуумному фракционированию, отделяя ниэкомолекулярные олигомеры (0,4-0,5 кПа, 100-150 С). Выход соединения формулы (1) 320 r (777).

Строение полученного соединения

r подтверждается данными элементного анализа, определения молекулярной массы и ИК-спектроскопии.

Найдено,X: С 55,01; Н 9,72;

N .3,08.

1089090

Вычислено, %: С 54,66; Н 9,33;

N 3,19.

Молекулярная масса расчетная 436, экспериментальная 425.

ИК-спектры сняты на спектрофотометре "Spekord-75" в кюветах CaF .

Толщина слоя 0,8 мм, растворитель

CCtg, остаточное содержание влаги в образце не превышает 0,1Х, t0

При сравнении ИК-спектров полученного соединения и исходного морфолина

I оказалось, что наиболее сильные различия наблюдаются в области поглощения валентных колебаний амино-и оксигрупп (3600-3200 см 1). Если в спектре исходного соединения поглощение с максимумом средней интенсивности появляется

-1 полоса поглощения при 3320 см, относящаяся к валентным колебаниям аминогруппы, то в спектре оксиэтилированно.20 го производного вместо нее появляется широкая сложная полоса поглощения при.3400-3595 см, обусловленная валентными колебаниями ассоциированных гидроксильных .групп полиоксиэтилено25 вой цепи. II

Отсутствие полосы, обусловленной колебаниями аминогруппы в ИК-спектре полученного соединения, свидетельствует об отсутствии в целевом продук 0 те непрореагировавшего исходного соединения.

Полосы поглощения валентных и деформационных колебаний СН -групп в области 3000-2800 и 1400-1200 см 35 отражают характер поглощения колебаний полиоксиэтиленовой цепи.

Исследование криопротекторных свойств, соединения формулы (1) проводят следующим образом. 40

Суспензию клеток почки эмбриона свиньи версенизированную (СПЭВ) 242 пассажа и:криопротектор, К-оксиэтилгепта(оксиэтилен)-морфолин охлажо 45 дают в холодильнике до 4 С, после чего к суспензии при осторожном перемешивании в соотношении 1: 1 добавляют раствор криопротектора, .приготовленный на среде 199 с рН 7,4.

Концентрация клеток (конечная) в

50 суспензии 8 млн в 1 мл.

Клетки выращивают в монослое на среде 199 с добавлением 10Х сыворотки крови крупного рогатого скота и по 100 ед. пенициллина натриевой соли и стрептомицина хлоркальциевого комплекса на 1 мл питательной среды.

Выбор оптимальной концентрации криопротектора и режима охлаждения клеток осуществляют в условиях многофакторного эксперимента при разных концентрациях криопротектора от

1,5 до 15% (конечная концентрация) и скоростях охлаждения. Наилучшие .результаты получают при использовании криопротектора в 4,5-5,5%-ной концентрации. При более низких и при более высоких (15%) концентрациях формирование монослоя значительно (в 2-3 раза) запаздывает по сравнению с контролем (нативный материал).

При этом монослой выполняют отдельными островками, в ряде случаев-сливающимися, его рисунок сглажен. Требуется проводить замену питательной среды (1-3 раза) или пересев клеток.

Таким образом, отклонение концентрации криопротектора от оптимума приводит к тому, что время формирования моноелоя в 2-3 раза превышает время его выполнения при оптимальной концентрации.

Суспензию клеток, смешанную с о криолротектором, инкубируют при 4 С в течение 15 мин,. затем разливают в стеклянные ампулы по 2 мл, которые после запаивания помещают в контейнеры. Весь период эквилибрации клеток в среде криопротектора составляет

40 мин.

Замораживание суспензии ведут по двухэтапной программе: со скоростью

1 С мин до -10 jt затем lU C/ìèí до -196 С. Оттаивание проводят в воо о дяной бане при 41 С.

После оттаивания жизнеспособность клеток оценивают по результатам прижизненной окраски трипановым синим (86%).

По морфологическим признакам клетки СПЭВ сохраняют в монослое эпителиоподобную форму, имеют вид неправильного четырехугольника. Цитоплазма клеток гомогенная, немного мелкозернистая. Ядра клеток округлой формы, реже овальной с 2-5 ядрышками.

Митотическая активность размороженных клеток не отличается от клеток, не подвергшихся замораживанию (контроль).. В первые сутки роста после размораживания в культуральной среде на матрасах митотическая активность составляет 33,3+ 1,5Х, на вторые сутки 39,0+6,1% и на третьи

1089090

% а

43,0 1,5Х. Монослой деконсервирован- дования криопротекторных свойств соеных и контрольных клеток формируется . дннения формулы (1) представлены йа третьи сутки роста. Результаты иссле- в таблице.

Сравнение криоэащитных свойств соединения формулы (1) и ДМСО !

Криопротекторы

Показатели

Соединение формулы (1) ДМСО

Конечная концентрация криопротектора, Х

4,5-5,5

Отмывание размороженных клеток с двукратным центрифугированием

Не требуется

Требуется

° 8.6

Жизнеспособность, Х

Рост клеток в монослое,. сут

4-5

2 г

1 мес. Срок хранения в результате чего исключает удаление его из клеток путем многократного отмывания, не снижает пролиферативную активность деконсервированных клеток, что значительно повышает производительность труда.

Составитель Н.Капитанова

Редактор Л.Пчелинская Техред М.Тепер Корректор С Шекмар

Заказ 2863/21

Тираж 410 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Соединение формулы (f) в качестве криопротектора обеспечивает криозащиту при концентрации 4,5-5,5Х, что в

2 раза меньше необходимой для этих целей концентрации ДМСО. Формирование монослоя клеток культуры СПЭВ после консервирования с соединением формулы (2) происходит в течение

3 сут (аналогичио контролю),что уменьшает расход питательных сред. Соеди- 4 наине формулы (1) в качестве криопротектора не требует отмывания, что упрощает и удешевляет процесс консервирования, и устойчиво при хррнении (до 2 лет).

Таким образом, И-оксиэтилгепта (оксиэтилен)-морфолин может эффективно использоваться в качестве криопротектора при замораживании клеточных культур. Предлагаемый криопротектор экономичен, поскольку применяется в относительно низкой концентрации, не обладает токсичностью для клеток,