Питательная среда для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы

Питательная среда для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КСИЛАНАЗЫ, содержащая источники углерода, азота, витаминов, аминокислот, источник минерального азота - азотнокислый ... / рий, а также минеральные соли - однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения активности продуцентов и 1 удешевления среды, она дополнительно содержит в качестве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки при следую.щем соотношении компонентов, мас.%: Азотнокислый натрий0,3 Однозамещенный фосфорнокислый каший0,2 Сернокислый i магний0,05 Солодовые ростки1,5-4 (Л Вода, млДо 100

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН,SU„„A

3(59 С 12 I«I 1/14; С 12 Н 9/42

В

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, 3

H ABTOPCHOIVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

0,05

1,5-4

До 100

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3554000/28-13 (22) 29,12,82 (46) 07.05.84.Бюл. 9 17 (72) И.И.Иванова, Э,П,Гужова и Л.Г.Логинова (71) Институт микробиологии AH СССР (53) 577. 15 (088. 8) (56) 1, Авторское свидетельство СССР

9 448822449944, кл. С 12 N 9/42, 1973.

2. Логинова Л.Г. и др, Целлюлоза микроорганизмов. М., НаУка i 1981, с. 9 4 (прототип) ° (54) (57) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ПРОДУЦЕНТОВ ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ И КСИЛАНА3bl, содержащая источники углерода, азота, витаминов, аминокислот, источник минерального азота — азотнокислый натрий, а также минеральные соли — однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислый магний и воду, о т л и ч а ю щ а я с s тем, что, с целью повышения активности продуцентов и удешевления среды, она дополнительно содержит в качестве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки при следую.щем соотношении компонентов, мас, Ъ:

А зот но ки слый натрий 0,3

Однозамещенный фосфорнокислый калий 0,2

Сернокислый магний

Солодовые ростки

Вода, мл

10907 13

О, 3., 60

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается питательных сред для выращивания продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы культуры Tricgodermy

lignorum 60-24, содержащая пшеничны

5 отру би, свекловичный жом, солодовые ростки flj .

Недостатками этой среды являются . сложный состав, содержащий большой набор минеральных солей и мнкроэле- )О ментов, что значительно ее удорожает, а также низкая активность ксила,назы.

Наиболее близкой к изобретению является питательная среда для выращи- 35 вани я продуцента целлюлолитических ферментов н ксиланазы Aspergillus

terreus 17р (2), где в качестве источника углерода используют измельченную пшеничную солому 2%,. в качестве источника углерода, азота, витаминов, аминокислот — кукурузный экстракт

1,5%, как источник минерального азота NaNO О, 3%, а также KH P04 0,2%; ,,MgSO4 7Н О 0,05%, водопроводная во- 25 да рН 4,5.

На этой среде ферментативная акТивность гриба Asp terreus. 17p ха- . рактеризуется следующими величинами, единица активности (миллилитр куль- туРалы)ой жидкости): эндбглюканаза

25; экзоцеллобиогидролаэа 1,0у целлобиаза 0,6> кснланаза 73.

Недостатками этой среды являются ее многокомпонентность, высокая стоимость и недостаточно высокая фермент ативная активноСть выращиваемых на ней продуцентов.

Целью изобретения является повы-! шение активности продуцентов и удешевление среды. 40

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для культивирования продуцентов целлюлолитических ферментов и ксиланазы, содержащая источники углерода, азота, вита- 45 минов, аминокислот, источник мине -. рального азота - азотнокислый натрий а также минеральные соли - однозаме/ щенный фосфорнокислый калий, сернокислый "магний и воду, содержит в ка- 50 честве источника углерода, азота, витаминов и аминокислот солодовые ростки прн следующем соотношении компонентов, мас.%:

Азотнокислый натрий

Однозамещен ный фосфорнокислый калий 0,2

Сернокислый магний 0,05

Солодовые ростки 1 5-4 0

Вода, мл До 100

Ферментативная активность продуцентов, выращенных на предлагаемой среде, отличается высокими показа- 65 телями и составляет для Aspergillus

terreus l7p и Myceliophthora therворЫ.1а по эндоглюканазе 40-42 ед/мл,. зкзоцеллобиогидролазе 1,0-3, 8 ед/мл, целлобиазе 1,2-2,7 ед/мл, ксиланаэФ

95-420 ед/мл. .Преимущество предлагаемой среды заключается в том, что в качестве единственного и одновременного источника углерода, витаминов, аминокислот, а также азота среда содержит солодовые ростки в количестве 1,54,0 мас.%.

Солодовые ростки являются дешевым отходом пивоваренного производства „ и могут быть непосредственно без д0полнительной обработки введены в состав питательной среды.

Содержание солодовых ростков менее 1,5 мас.% приводит к снижению активности ферментов, а более 4 мас.% приводит к удорожанию среды без доста/ точного повышения активности всех ферментов .

Пример 1. Берут питательную среду следующего состава, мас,%: солодовые ростки 1,5; NANO> О, 3;

КН Р04 0,2; MgSO< 7Н О 0,5;. вода водойроводная рН 4,5, и на ней проводят выращивание продуцента Myceliophtora thermophila ИНИН PA 1-8, который депонирован под 9 ВКМ-F-2148 Д, Спорами, полученными при выращи,вании культуры на перловой крупе в течение 6 сут, засевают! колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл предлагаемой среды. Выращивание про-! водят на круговой качалке (180 об/баян) ,в течение 72 ч при 45 . Мицелий с твердыми остатками среды отделяют центрифугированием, Центрифугат используют для определения активности фермент ов.

А кти вност ь целлюлолитиче ских ферментов определяют по известной методике Мэндельс и Вебера в модификации, измеряя количество образовавшихся редуцирующих веществ (в перерасчете на глюкозу) при действии целлюлаз на соотвествующие субстраты (Na " карбоксиметилцеллюлозу, фильтровальную бумагу, целлобиозу). Редуцирующие вещества определяют колориметрическим методом Шомоди-Нельсона при длине волны 660 нм в кювете с толщиной слоя раствора 5 мм

3а единицу активности целлюлаз принято такое количество ферментов, под действием которого при условиях опыта образуется 1 мг редуцирующих веществ в перерасчете на глюкозу.

Активность ксиланазы определяют по действию фермента на 1%-ный раствор ксилана. Реакционная смесь состоит из 0,72 мл ксилана, 0,25 мл культуральной жидкости соответствующего разведения. Инкубацию проводят в течение 1 ч. Редуцирующие вещест1090713

Сбставитель И.Привалова

Редактор Н.Джуган Техреду Л.Микеш Корректор О.Билак

Заказ 3015/23 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ва определяют методом Шомоди-Нельсона. Калибровочную кривую строят по ксилозе. За единицу активности ксиланазы принимают, такое количество фермента, под действием которого образуется 1 мг ксилозы в условиях опыта, Ферментативная активность продуцента имеет следующие показатели, ед/мл: эндоглюканаза 38; экзоцеллобиогидролаза 3,8; целлобиаза 2,3; ксиланаза, 370.

Пример 2. Берут питательную среду следующе ro сост ав а, мас, Ъ: солодовые ростки 4; NANO> О, 3; КН4РО

О, 2; МАМБО 7Н О О, 05; водопроводная t5 вода рН 4,5, и на ней проводят выращиванив штамма Nyce liophthora thermophila ИНМИ PA-1-8.

Посев, условия выращивания и определение активности ферментов осуще- 2() ствляют по примеру 1.

Ферментативная активность продуцента за 72 ч роста достигает следующих показателей, ед/мл: эндоглюканаза 42; экзоцеллобиогидролаза 3,9; целлобиаза 2,71 ксиланаза 420.

Пример 3. Берут питательную сРеду следующего состава, мас,Ъ: солодовые ростки 2,5; NANO> 0,3; КН РО

0,2; MgSO 7Н О 0,05; водопроводная 30 вода рН 4,5, и на ней проводят выращивание штамма Aspergillus terreus

17 р, депонированного под Р -P-1862.

Суспензией спор, полученной смывом с поверхности плотной питательной среды, содержащей (Ъ: NaNO< 0,3у

NH<РО 0,2; МдЯО4 ° 7Н О 0,05, с полоской фильтровальной бумаги в качестве источника углерода, засевают 100 мл предлагаемой среды. Продуцент культивируют в колбах на 250 мп на круго- 40 вой качалке (220 об/мин) при 40 в течение 96 ч, Активность ферментов определяют в культуральной жидкости после отделения центрифугированием мицелия и твердых остатков согласно 45 примеру 1.

При культивировании гриба Asp.

terreus 17р на предлагаемой среде получены следующие результаты, ед/мл: эндоглюканаза 40у экзоцеллобиогидро- 50 лаза 1,0; целлобиаза 1,2; ксиланаза

96Ä! i Как видно из приведенных результатов предлагаемая среда обеспечивает

I более активный биосинтез целлюлолитических ферментов и ксиланазы.

Солодовые ростки в качестве источ. ника азота, углерода, нитаминов и аминокислот заменяют одновременно два компонента — дорогостоящий кукурузный экстракт, получаеьий из пищеного сырья, и солому, на размол и усиленный режим стерилизации которой .требуется значительный расход энергии, Солодовые ростки очень. богаты углеводами, аминокислотами, азотисты, ми и минеральными вещест.нами, витамйнами, содержат до 12% целлюлозы и ксилан. Целлюлоза и ксилан являются индукторами биосинтез а указанных ферментов, Солодовые ростки являются отходом пивоваренного производства,,их стоимость н 2, 4 раза ниже куку :рузного экстракта.

Mycel1ophthora thermophila синтезирует ксиланазу .с активностью 370, 420 ед/мл, которая значительно превышает активность известной. Наряду с ксиланазой образуется комплекс . целлюлоз с особенно актинной эндоглюканазой, накапливается значительная биомасса гриба, В настоящее время известна питательная среда для культивирования

Asp. niger 15 в опытно-промпаленном масштабе, Получены партии ферментного препарата. Недостатком этой среды является ее сложный состав и довольно низкая активность ксиланазы (20 ед/мл) при длительном культивировании продуцента (7 сут) .

В занодских условиях получена высокоактивная культуральная жидкость гриба Asp, terreus 17р, которая испытывается в сельском хозяйстве при облагоражинании грубых кормов для животных. В опытно-промышленных условиях также получены партии ферментного препарата, которые будут переданы для;дальнейшей очистки во ВНИТИАФ медицинского назйачения (г.Ленинград) с целью создания полиферментной лекарственной форкы.