Циклический пентапептид, обладающий анальгетической активностью

Циклический пентапептид, обладающий анальгетической активностью

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Циклический пентапептид формулы Tyr-D-Orn-Gly-Phe-Asnобладающий анальгетической активностью . т СП СП 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ. социАлистичесних

РЕСПУБЛИК

А1 ()9) (И) ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

8 ..К8 ("

11МИПм

g>>.1ÁÃ

Tyr-D-0m-Qly-Phe-AsnГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ пО изоБРетениям и ОткРытиям пРи Гннт сссР

1 (21) 3561617/23-04 (22) 24.11.82 (46) 30.08.89. Бюл. У 32 (71) Институт органического синтеза»

АН ЛатвССР (72) Г.И. Чипенс, И.В. Боброва, Н.А. Абиссова и И.П. Секацис (53) 547.964.4.07(088..8) (56) Hughes J., Smith Т.W., Rosterlitz Н.W., Fothergill Ь.А., Morgan В.А., Morris Н.R. "Identification of two related pentapeptides

from the brain with potent opiate

agonist activity" Nature 1975, ч.253, 577.

Buescher Н:Н., Hill R.Ñ., Romer D., Cardinaux F., Closse А., .Насser D., Pless J. "Evidence for

analgesic activity of enkephalin in

the mouse" Nature 1976, v. 261,423.

Hudson D., Sharpe R., Szelke М., "Methionine enkephalin and isosteric

analogues", Int. J. Peptide Protein

Res. 1980, ч.15, 122.

Kessler Н., Holzemann G., "CycloLeu -Enkephalin" Angew. Chem. Int.

Ed. Engl., 1981, 20, У 1, 124.

Di Maio J..Schiller P.W. "А cyclic

enkephalin analog with high in vitro

oprate activity", Proc ° Natl Soil

USA 1980, v. 77, N 12,,7162. г

Изобретение относится к новому биологически активному химическому соединению — к циклическому пентапептиду — аналогу энкефалина, обладающему анальгетической .активностью, ко(р, С 07 К 7/64, 7/06, А 61 К 37/02

2 (54) ЦИКЛИЧЕСКИЙ ПЕНТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Циклический пентапептид формулы обладающий анальгетической активностью. торый может найти применение в меди-. цине.

Энкефалин — природный агонист опиатного рецептора в мозгу, бып выделен и идентифицирован в виде смеси двух

3 10955 гентапептидов:Н-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met0Н (метионин-энкефалин) и Н-Tyr-GlyGly-Phe-Leu-ОН (лейцин.-энкефалин).

Оба пептида проявляют морфиноподоб5 ную активность в опытах на специфических моделях опиатного рецептора, а также подавляют стереоспецифическое связывание с рецептором опиатного антагониста налоксона в гомогенатах 10 мозга.

Met- u Leu-энкефалины показывают анальгезию в течение 5-15 мин при внутрижелудочковом введении в мозг мьппи. 15

Известны циклические аналоги энкефалина, включающие в цикл 18, 15 атомных группировок (см.табл.1), однако они показывают полное отсутствие специфической активности энкефа- 20 лина.

Наиболее близким по химической структуре является циклический аналог энкефалина (7)(см.табл.1), однако анальгетическая активность это- 25 го соединения не исследована.

Целью настоящего изобретения является расширение арсенала средств воздействия на живой организм, создание аналогов энкефалина, обладающих анальгетической активностью.

Поставленная цель достигается описываемым циклическим пентапептидом формулы:

Tyr-D-0m-Gly-Phe Asn35

« обладающим анальгетической активностью.

Синтез пептида осуществляют известными методами пептидной химии в растворе согласно приведенной схеме с использованием активированных эфиров трет-бутилоксикарбониламинокислот., g -Аминофункцию D-орнитина за щищают бензилоксикарбонильной груп- 5 пой, гидроксил тирозина — трет-бутилоксикарбонильной группой.

На чертеже приведена схема .синтеза.

Пример. Для синтеза аналога

>О энкефалина 1 используют аминокислоты и их производные фирмы "Reanal" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме 9орнитина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют 5 в капилляре (без коррекции). Индивидуальность промежуточных соединений контролируют с помощью ТСХ на плас. тинках "Silufol 1Л п. " (ЧССР). Для

87

4 хроматографии аналога энкефалина применяют стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля "Silika C el

60 F-254" фирмы "Merck" (ФРГ). Использукт следующими системы растворителей: хлороформ — этанол — уксусная кислота (АсОН), 85:10:5 (А), н — бутанол — пиридин - Ac0H — Н О, 15:10:

:3:6 (В); н-бутанол — АсОН вЂ” Н О, 4:1:1 (С), хлороформ — метанол — АсОН—

Нпо, 30:20:4".6 (Л), 60:18е2:3 (Е), н-бутанол — пиридин — АсОН вЂ” Н О, 15:12:3:10 (F) Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на поляриметре "Perkin Elmir 141 М" (ФРГ).

Кислотный гидролиз проводят при 120 С в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на анализаторе

"Jeol-3", для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием С,Н,Н.

Иолекулярный вес циклопептида определен масс-спектрометрически на приборе СН-5 Varian MAT (США) . при о температуре приблизительно 250 С и ионизирующем напряжении 70 эВ.

N-трет-бутилоксикарбонил-глицил-фенилаланин (9).

6,6 г (40 ммоль) L-фенилаланина растворяют в 40 мл 1 н.раствора гидроокиси натрия, добавляют 3,34 r бикарбоната натрия, 50 мл диметилформамида (ДМФА) и 16,94 r (40 ммоль) пентахлорфенилового эфира трет-бутилоксикарбонил-глицина, растворенного в 20 мл ДИФА. Смесь перемешивают в течение нескольких часов. После завершения реакции (хроматографический контроль) реакционную массу разбавляют . этилацетатом и водой (до разделения слоев), охлаждают до О и подкисляют 0 5 н, соляной кислотой до рН 3. Этилацетатный слой отделяют, водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетатный слой промывают водой,насьпценным раствором хлористого натрия и сушат над безводным сульфатом натрия. Кристаллический осадок, полученный после отгонки растворителя, перекристаллизовывают из этилацетата с небольшой добавкой петролейного эфира. Выход дипептида (9 ) 11 4 г (88X) T.ïë, )33-135 С,(chal п +15,7 (с 1, ДИФА), Rf 0,73 (А), Rf 0,80 (Л).

5 10955

N" -трет-бутилоксикарбонил, N бензилоксикарбонил-D-орнитил-глицил-фенилаланин (1 1).

10,9 r (33,8 ммоль) дипептида (9) растворяют в 50 мл 70%-ного раствора трифторуксусной кислоты (TFA) в дихлорметане и выдерживают 30 мин.

Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром,. отфильтровывают, про- 10 мывают эфиром на фильтре и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают 10,4 r (91X) трифторацетата дипептида (10), Rf 0,63 (Д).

5,2 r (15 5 ммоль) трифторацета- 15 та (10) растворяют в 50 мл ДИФА, охлаждают до 0 С и при охлаждении добавляют. 2,65 мл (15,5 ммоль)диизопропилэтиламина в 5 мл ДМФА и 8, 2 r (15,5 ммоль) пентафторфенилового эфира Ф-трет-бути-20 локсикарбонил, N -бензилоксикарбонил-D-.îðíèòèíà, растворенного в 15 мл

ДМФА. Реакционную массу перемешивают . несколько часов и после завершения реакции обрабатывают аналогично соединению 9. Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы "Иегс1с".

", Элюирование проводят в системе: хлороформ-этанол-этилацетат-АсОН-Н О, 30

285:5:8:2:0,25. Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат в вакууме.

Получают 5,9 г (67 ) масла защи- щенного трипептида (11) с Rf 0,65 35 (А), Ы 0,72 (В).

N,О-ди-трет-бутилоксикарбонил-тирозил-N -бензилокси-карбонил-DB»

-орнитил-глицил-фенилаланин (13).

20,0 г (35 ммоль) трипептида (11) 40 растворяют.в 100 мл 50 -.ного раствора TFA в дихлорметане и выдерживают в течение 20 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром.

Образовавшийся осадок отфильтровы- 45 вают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисьюкалия. Получают 19,2 г (94 ) трифторацетата трипептида: (12) с Rf 0,62 (Д).

18,1 r (31 ммоль) трифторацетата 50 трипептида (12) растворяют в 100 мл

ДМФА, охлаждают до 0 С, добавляют при перемешивании 5,3 мл {31 ммоль) диизопропилэтиламина в 10 мл ДИФА и

16,6 г (31 ммоль) пентафторфенилово- 55 го эфира N, О-дис-Вос-L-тирозина.

Реакционную массу перемешивают 1,52 ч (хроматографический контроль) и после заверШения реакции обрабаты87 вают аналогично соединению 9. Продукт, полученный после отгона этилацетата размешивают с эфиром и охлаждают. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в эксикаторе. Выход 16,0 (62 ) защищенного тетрапептида (13) с Rf 0,75 (А), Rf 0,55 (В, "Merck",) (о Д р + 5,6 (с

1, ДЕФА).

N,О-ди-трет-бутилоксикарбонилтирозил-1Ч вЂ (N -бензилоксикарбонил-асг парагилЦ -D-орнитил-глицил-фенилаланин (15).

К 18 r (22 ммоль) защищенного тет" рапептида (13) в 150 мл метанола, 15 мл АсОН и 20.мл Н О добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение нескольких часов. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром.и фильтруют, затем дважды переосаждают из спирта эфиром, вновь промывают эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия.

Получают 13,8 г (91X) тетрапептида (14) с Rf 0,15 (А) Rf 0,72 (Д, "Merck ); Rf 0,77 (Р, "Merck").

5,1 г (6,8 ммоль) тетрапептида (14) растворяют в 100 мл ДМФА и при перемешив анин и охлаждении добавляют

1, 16 мл (6,8 ммоль), диизопропилэтиламина в 3 мл ДМФА и 3,3 r (618ммоль) нитрофенилового эфира Ф-бензилоксикарбонил-L-аспарагина, растворенного в 15 мл ДМФА. Через 2-3 ч реакционную массу обрабатывают аналогично соединению. 9. Продукт, полученный после отгонки растворителя, очищают на колонке с силикагелем фирмы

"Merck". Элюирование проводят в системе: хлороформ — этанол — этилацетат — АсОН вЂ” Н О, 185:5:8:2:0,25.

Соответствующие фракции собирают, упаривают и сушат s вакууме. Получают 4,6 г (70X) с Rf 0,72 (А), Rf 0,83 (Д); P oLj +8,2 (С 1, Д1ФА).

N, О-ди-трет-бутилоксик арбонилтирозил-цикло(-N -D-орнитил-глицил-фенилаланил-.аспарагинил)(17), К 700 мг (0,73 ммоль)защищенного пентапептида (15) в 60 мл метанола, 4 мл АсОН и 1 мл воды добавляют палладиевую чернь и гидрируют в течение 2-3 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме над гидроокисью калия. Получают

560, мг (94X) пентапептида (10) с Rf

0,07 (А), Rf 0,70 (Д).

1095587

Тирозил-цикло (-Ф-D-орнитил- глицил-фенилаланнл-аспарагищы) (1) .

415 мг (0,52 ммоль) защищенного циклического пентапептида (17) раст5 воряют в 10 мл 70%-ного раствора ТРА в хлористом метилене и выдерживают

30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром и сушат в вакууме. Полученный продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией иа хроматографе "Du Pont-830"

Элюирование осуществляют смесью: этанол -0,1 М ацетат аммония, 13:87. Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют.

Выход: 120 мг (38%) циклопентапептида энкефалина (1), )eQ +36 (с 0,5, Ac0H); Rf 0,62 (В, "Nerck"); Rf 0,78

20 (Д, "Nerck"), аминокислотный состав:

Tyr 0,93, Gly 1,00, Phe 0,91; Огп

0,95, Asn 0,98.

1 . Н циклического пентапептида

Химические сдвиги

Н

-СН=

7,13

6,88

4,09

3,18

3,00

1,67

1,21

Tyr

1,38

3,97

4,08

3,67

4,37

4,61

3,39

2,90

Gly

1,4-1,25

3,1

2,90

2,56

Phe

Asn

Величина расчетного молекулярного веса совпадает с его экспериментальным значением, определенным массспектрометрически (И = 595).

Биологическая активность аналога энкефалина (1) исследована в опытах

in vivo. Анальгетическую активность определяли по методу Н.Veda.

В работе были использованы беспородные мыши-самцы массой 18-22 r.

Исследуемое вещество, растворенное в стерильном физиологическом растворе, вводили при помощи У-образной иглы в cisterna magna мозга неанестезированным мышам в количестве

10 мкл. Исследовался диапазон доз от О,1 до 0,5 мкг/жнвотное. Контрольным животным вводили 10 мкл стерильного физиологического раствора. При

800 мг (0,98 имоль) пентапептида (10) растворяют в 800 мл очищенного

ДИФА, охлаждают до -20 С, прибавляют .триэтнламин в ДИФА до рН 7,2 и затем медленно прикапывают 0,63 мл (2,94 ммоль) дифенилфосфорилазида в

50 мл ДИФА. Раствор перемешивают в течение 7 дней и поддерживают рН около 7 периодическим добавлением триэтиламина к реакционной массе.

По завершении реакции растворитель отгоняют при 40 С, к остатку добавляют 1,5-2 мл этилацетата и небольшое количество эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром, сушат в вакууме, получают 415 мг белого порошка защищенного циклического пентапептида (17). Ввиду плохой растворимости (17)очистку не проводят. внутривенном введении препарат вводился в хвостовую вену мышей в диапазоне от 15 до 30 мг/кг. Каждая экспериментальная группа состояла из 810 мышей. Анальгетический эффект оценивали по методу "tail pinch" при помощи артериального зажима накладываемого на основание хвоста, Определение болевой реакции проводилось через 5,15,30,60 и 90 мин после введения.

Результаты выражены альтернативным методом в проценте. мышей, показавших анальгетическую реакцию.

lIpH вычислении ЕД ss (эффективная До эа исследуемого вещества, которая вызывает анальгетический эффект у 50% подопытных животных)используется метод Литчфилда и Уилкоксона.!

095587

Аналоги энкефалина

Количество соеди нения

Формула соединения атомных группировок в цикле пептида

Tyr-D-Orn-Gly-Phe-Asn

Tyr-Gly-G1ó-Phe-Leu»

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met+

NH-CH-CO -Tyr-Gly-Cly-Phe Met

NH- СН -СН -Tyr-Gly-Oly-РМ-Меt

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

Tyr-D-А bu-Gl y-Phe-Leu

2

4

17

18 18

14 Линейные природные энкебалины.

1 1 Анальгетическая активиость цикло-(N -D-Orn

Азп ) -знкефалииа при интрацистериальном введении мышам (метод "tail pinch") ЕД о 1 нмоль/животное

Продолжительность

Относительная анальгетическая активМомент максиСоединение мального эффекта, мин аиальге1 зии мии ность морфин !!. Цикло-(N -D-Orn

Asn )-знкефалии

2. Leu-энкефалии

3. Met-энкефалин

8. Морфин 2

0,007

0,008 !

- 15

5

5

5-!5

0,3(0,2-0,5) !

74(!02-28I)

154(90-261)

1,2(0,6-2,2) 1 IlpH ЕД

2 — В работе использовался морфин- гидрохлорид производства Ташкентского ХФЗ., Анапы етическая активность исследуемых соединений приведена в табл.

2и3.

Цикло- (N -D-Orn, Asns )-энкефалин, 8

1 обладает выраженной анальгетической активностью. Максимальный эффект наблюдается на 5,.-ой минуте после вве° дения. Анальгетическая активность нового аналога энкефалина 10 значитель- Ip но превышает активность природных энкефалинов (2,3) и в 4 раза превышает активность морфина в молярных соотношениях при интрацистернальном введении мыл ам (cM.табл.2). !

Цикло-(N -D-Orn, Asn )- энкефалин ,(1) в отличие от природных энкефалинов активен при внутривенном введении. Он обладает 607 активности морфина при внутривенном введении (см. 20 табл.3).

Циклоаналог энкефалина 1 показывает более продолжительный анальгетический эффект, чем природные энкефалины. Продолжительность анальгеэии нового аналога (1) сопоставима,с,продолжительностью анальгетического эффекта морфина при обоих способах введения и сострвпяет 60 мин (см. табл . 2,3)

Эффективная доза описываемого соединения (ЕД ) при внутривенном введении составляет 30 мкмоль/кг, или

22 мг/кг. При введении в дозе

500 мг/кг не наблюдается токсических эффектов, следовательно терапевтический индекс данного соединения составляет величину, большую, чем

500 Ф

22 (= 22). что является безопасным интервалом для терапевтического средства.

Полученные результаты позволяют предполагать использование описываемого соединения в медицине.

Таблица 1

109558?, Таблица3

Анальгетическая активность никло-(N -D-Огп

Asn ) — энкефалина при внутривенном введении мышам (метод "tàil pinch") Относительная анальПродолжительМомент максиЕД ммоль/кг

Соединение ность анальгемального эффекта, мин зии при

Дба - во мин

100

5 60

5-15 60

30(18-51)

l8(15-22) Phr

Редактор Л. Письман

Эакаэ 49?5 Тираж 339 Подписное

ВЯКНИ Государственного комитета по иэобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэводственно-иэдательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

Цикло-(5 -D-Orn Asn )

1 5 энкефалин

Морфин

Техред М.Моргентал Корректор М. Пожо гетическая активность (морфин

100%)