Химически модифицированный носитель на основе кремнезема и способ его получения

Химически модифицированный носитель на основе кремнезема и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1.Химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащий на поверхности группы формулы -(с1Нг)з-0- Нг-с1н-енг для иммобилизации биологически активных соединений. (Л со -vj ел СП 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) SU (Ill

Щ омл и&осл ь е/

100

0

2 3 Ф 5 6 7 б .У 10 Время, сусл и (21) 3484999/23-26 (22) 06.08.82 (46) 15.06.84. Бюл. Р 22 (72) Я.Я.Гибиетис и А.А.Пуце (53) 661.183.7:546.287:577.15.03 (088.8) (56) 1.Иммобилизованные ферменты.

Под ред. И.В.Березина, В.К.Антонова, К.M.Ìàðòèíåíà. Из-во МГУ, 1976,т. 1,с.296.

2.Патент США 9 3983299, кл. 428-405, 1976 (прототип) .

3(511 С 01 В 33/18; В 01 5 20/10 (54) ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫИ HOCHTEJIb НА ОСНОВЕ КРЕМНЕЗЕМА И СПОСОБ

ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ.

i(57) 1.Химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащий на поверхности группы формулы — Н -O- Н,— Н-аН2

23

1 для иммобилизации биологически активных соединений.

1097558

Изобретение относится к способу получения химически модифицированных кремнеземных носителей и может быть использовано для иммобилизации биологически активных соединений — 5 ферментов, их ингибиторов, кофакторов.

Известны модифицированные органическими соединениями кремнеземные носители, используемые для иммобили- 1(} зации биологически активных веществ (1).

Однако известные носители предназначены для иммобилизации соединений. содержащих лишь определенные функциональные группы и во многих случаях их необходимо дополнительно активировать.

Наиболее близким к предлагаемому является носитель (2) на основе макропористого кремнезема,- содержащий на поверхности группы формулы ( (>ã3 Π— 4 з

Указанное соединение привито к поверхности кремнезема гидролитичесски прочной системой связей == si

-0 — Вi — С. Эпоксидные группы но/ сителя способны реагировать с функциональными группами (— OH — NH ! 2

SH} биологически активных молекул, что определяет возможность использования данного носителя для иммобилизации широкого набора Ферментов, ингибиторов и др.

Носитель с привитыми эпоксигруппами получают обработкой кремнезема раствором у -глицидилоксипропилтри- этоксисилана в воде или органическом растворителе (2)

4О

Однако при иммобилизации на данном носителе биологически активных молекул, содержащих тиольные группы, помимо эффекта иммобилизации наблюдается потеря биологической активнос- 45 ти. При этом полученные препараты им. мобилизованных биологически активных молекул данного химического строения под воздействием кислорода быстро теряют свою активность, так как тиоль (" 4 з O=< ã

,б для иммобилизации биологически активных соединений.

Способ получения химически модифицированного носителя на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема (-глицидилоксипропилтризтоксисиланом до содержания на поверхности носителя эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г обработанный (-глицидилоксипропилтриэтоксискланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевин в коли ест" ве 20-100 моль на 1 моль эпоксигрупп, в среде апротонного растворителя при

50 †1

2.Способ получения химически мо- ° дифицированного носителя на основе кремнезема, включающий обработку кремнезема f — глицидилоксипропилтриэтоксисиланом до содержания на поверхности носителя эпоксидных групп в количестве 15-1000 мкмоль/г, отличающийся тем, что обработан ный. (- глицидиоксипропилтриэтоксисиланом кремнезем дополнительно обрабатывают тиоцинатом щелочного металла или тиомочевиной в количестве 20 — 100 моль на

1 моль эпоксигрупп в среде апротонного растворителя при 5010PÎC ные группы легко окисляются кислоро-, дом. При обычных условиях иммобилиза. ции (водный раствор, воздух), а также при хранении готового продукта, иммобилизируемое вещество (или иммобилизованное на носителе вещество) соприкасается с кислородом, что и приводит к потере их биологической активности.

Для избежания данного нежелательного явления, процесс иммобилизации биологически активных молекул, содержащих тиольные группы, на носителе известного строения обычно осуществляют в инертной атмосфере или в присутствии восстанавливающих агентов 2-меркаптоэтанола, дитиотреитола. Последние снижают выход и загряз. няют целевой продукт.

Цель изобретения — получение химически модифицированного носителя на основе кремнезема для иммобилизации биологических соединений, в том числе биологически активных молекул, содержащих тиольные группы.

Поставленная цель достигается тем, что химически модифицированный носитель на основе кремнезема с диаметрами пор 10-250 нм, содержащей на поверхности группы формулы

1097558

Сущность способа заключается в том, что носитель, содержащий на ,поверхности эпоксидные группы в количестве 15-1000 мкмоль/г обрабатывают в соответствии со схемой

5 м (.")би

P-(

О.

М40бя- 10

ТЧбНг)з О 0Hz (- Н сН+ С

Х где Р— кремнезему

М вЂ” щелочной металл. 15

Носитель общей формулы (1) получают с выходов 80-1004 в зависимости от структуры кремнеземной матрицы и условий реакции .

Носитель представляет собой макропористый кремнеземный материал, со. держащий на поверхности тиирановой группы в количестве 15-460 мкмоль/г носителя. Тиирановые группы носителя как и эпоксидные группы, способны реагировать с нуклеофильными функциональными группами биологически активных молекул, что приводит к иммо- билизации последних.

Иммобилизация протекает по следую З щей схеме

P-((!z,); о-бн,- н- нг+ мц-э

Р-(Н ) - О-СНг Н вЂ” бНг-Ч В 35

1I рН где Р— кремнезем;

6 — молекула биологически актив-40 ного вещества; (— О, НН, Таким образом, в процессе иммобилизации биологически активных молекул на носителе общей формулы (1) 45 образуются свободные тиольные группы. Образование этих групп позволяет использовать носитель для иммобилиза ции активных молекул, содержащих тиольные группы: свободные тиольные группы, находящиеся на поверхности носителя, служат в качестве восстанавливающего агента.

Полученный модифицированный кремнеземный носитель общей формулы (1) в процессе иммобилизации исполняет две функции: матрицы для иммобилизации и восстанавливающего агента.

Способ получения носителя осуществляется следующим образом. 60

Обработку исходного носителя, содержащего эпокси-группы, проводят избытком тиоцината щелочного металла или тиомочевины (на 1 моль эпок- сидных групп исходного вещества ис- 65 пользуют 20-100 молей соответствующего агента), обработку исходного вещества проводят в среде полярного апротонного растворителя, например диметилформамида (ДМФА), диметилсульфоксида (ДМСО) и др., при 50

100ОС.

При мольном соотношении тиоцината щелочного металла или тиомочевины к эпоксигруппам меньше чем 20:1 снижается выход реакции, соотношение больше чем 100:1 нецелесообразно.

При температуре меньше 50 С знаО чительно увеличивается время проведения реакции. При температуре выше

100 C протекают побочные реакции, приводящие к разрушению тиирановых групп.

Применение протонного растворителя приводит к раскрытию тиирановых групп до тиольных.

Полученный модифицированный кремнеземный носитель общей формулы (1) представляет собой белое вещество в форме гранул сферической или нерегулярной формы, нерастворимое в воде и органических растворителях, которое разлалается в концентрированных щелочах и в растворе фтористого водорода.

Структура нового соединения подтвержена элементным анализом, титриметрическим определением тиоэпоксидных групп.

Пример 1. 10,0 г силохрома

С-80, модифицированного f -глицидилоксипропилтриэтоксисиланом и содержащего 130 мкмоль/г эпоксидных групп, суспендируют в 50 мл диметилформамида (ДМФА) и при перемешивании добавляют раствор реагента, содержащего

5,8 г (бО моль} тиоцината калия в

50 мл ДМФА (соотношение 50:1). Перемешивают при 80 С в течение 2 ч, о фильтруют. Нерастворимый продукт промывают последовательно ДМФА, холод-. ной водой и ацетоном до полного удаления растворимых компонентов. Сушат в вакуумэксикаторе 5 ч.

Получают 10,0 целевого продукта.

Найдено, Ъ : $ — 0,38

Вычислено,%: S — 0,35

Содержание титрируемых тиопоксидных групп 112 мкмоль/г.

Выход по функциональным группам

93Ъ.

Пример 2. По примеру 1 осуществляют синтез носителя, изменяя температуру реакции, соотношение реагентов и тип исходного кремнеземного носителя.

В таблице представлены характерно тики носителей в зависимости от уcновий обработки (тип и количество релгента,температура, растворитель, время реакции).

1097558

Содержание эпоксигрупп, мкмоль/г

Модифицированный реагент

Исходный кремнезем

Примеры

Силикагель, (а00 =250 нм) 15

100

КБСН

Силикагель (а„ =10 нм) 570

ИаБСМ

ДМФА

110

Алюсил

ДМФА

КИСА

Пористое стекло

80(ЛН ) 90

ДМСО

Пример 3. 1,0 r модифициро ванного носителя, полученного по примеру 1, суспендируют в 10 ш фосфатного буферного раствора (рН 7.6) в котором растворено 10 мкмоль трилона Б, смесь встряхивают 15 мин ° Добавляют 100 мг трипсина, растворенного в 10 мл буферного раствора, и выдерживают смесь в течение суток .при 5 С, периодически встряхивая. о

Продукт фильтруют, промывают фосфатным буферным раствором и дистиллированной нодой. Продукт содержит 38 мг белка на 1 r сухого веса, удельная активность иммобилизонанного трипсина 42 ед/г. 1S

Пример 4 ° 50 мг уреазы в бикарбонатном буфере (10 мл 0,05 М, рН 8,6) инкубируют с 5,0 модифицированного кремнеземного носителя, полученного по примеру 1, при 2-5 С о в течение 2 сут, Продукт фильтруют, промывают буферным растнором с добав. лением 0,5 М Nacl. Продукт содержит

8 мг/г белка, удельная активность

70 ед/г. 25

Пример 5, Образец препарата, полученного по примеру 4, инкубируют и фосфатном буферном растворе (0,01 М, рН 7,5) при 15 С. В аналогичных услониях инкубируют уреазу, иммобилизованную на носителе, полученного по прототипу. Через определенные промежутки времени определяют уреазную активность препарата.

На чертеже изображена занисимость удельной активности уреазы от времени хранения.

Кривая A описывает изменение удель ной активности уреазы, иммобилизованной на предлагаемом носителе, кривая

Ь уреазы иммобилизованной на носителе — прототипе.

Таким образом, предлагаемый носитель за счет возникновения тиольных групп при иммобилизации соединений позволяет получать препараты иммобилизованных биологически активных веществ более устойчивые к окислению и сохраняющие свою активность на высоком уровне длительное время.

Технико-экономическая эффективность изобретения состоит в том, что использование предлагаемого носи. теля для иммобилизации биологически активных соединений позволит расширить ассортимент иммобилизованных препаратов, н частности биологически активных веществ, содержащих тиольные группы.

Количество

Растворитель реагента, моль на 1 моль эпокси групп

1097558

Продолжение таблицы

Выход, Ъ

Температура, С

Исходный кремнезем

Примеры

100

0,05 15

2.

1 54 460

98

0,33

3.

Алюсил

Пористое стекло

0,27 75

25

Составитель С. Старовцев

Редактор Н.Воловик Техред A.дч Корректор Ю.Макаренко

Заказ 4130/18 Тираж 464 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðoä, ул Проектная, 4

Силикагель, (6п =250 нм) Силикагель (й„ =10 нм) 100 пор

Время реакции, ч

Содержание тиирановых групп, мкмоль/г