Способ определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях
Патент 1099839
Авторы
Классы МПК
Способ определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях
Иллюстрации
Реферат
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА, ПЛАЗМИНА, ТРИПСИНА И ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гид ролиза фотометрически, спектрометрически или флюоресцентноспектрофотометрически , отличающийся тем, тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстрата используют вещество общей формулы R гли-про-X-NH-R или овщей-формулы R -гли-про-арг-NH-R , где R - водород или блокирующая ацильная или сульфанильная группа; R - замещенный ароматический а углеводородный остаток; (О X - аргинильнан или лизильная со группа.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕ(НИХ
РЕСПУБЛИН
3(51) G 01 N 33/48
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2440347/28-13 (62) 2373901/23-04 (22) 21.01.77 (23) 21.06.76 (31) 8224/75 (32) 23.06.75 (33) Швейцария (46) 23.06.84. Бюл. Р 23 (72) Ларс Гундро Свендсен (Норвегия) (71) Пентафарм АГ (Швейцария) (53) 612. 13 (088. 8) (56) 1. Збарский Б.И., Иванов И.И., Маддашев С.P. Биологическая химия.
М., Медгиз, 1960, с. 123-124. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРОМБИНА, ПЛАЗМИНА, TPHIICHHA И ТРОМБИНОПОДОБНЫХ ФЕРМЕНТОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем взаимодействия пробы биоло„.,SU„„> A гической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гид ролиэа фотометрически, спектрометрически или флюоресцентноспектрофотомет. рически, отличающийся тем, тем, что, с целью повышения чувствительности способа, в качестве субстрата используют вещество общей формулы
R = гли-про-Х-NH-R ! или овщей .формулы
R -гли-про-арг-NH-R
Ф где R — водород или блокирующая ацильная или сульфанильная группа;
R — замещенный ароматический
2 углеводородный остаток;
Х вЂ” аргинильная или лизильная группа.
1099839 или общей формулы
R -гли-про-apr-NH-R (2)
1 где R — водород .или блокирующая ацильная или сульфанильная группа;
R — замещенный ароматический углеводородный остатоку
Х вЂ” аргинильная или лиэильная группа.
Субстрат может быть протонизован минеральной кислотой, например НСХ,, HBr, H SO или Н РО,или органической кислотой, например муравьиной, щавелевой или винной. 40
R — ацильная группа может быть изображена частичной формулой R †СО-,, где R - алифатический углеводородный остаток с 1-17 предпочтительно 1-8, атомами С; аралифатический углеводородный остаток, алифатическая группа которого содержит 1-6 атомов С; циклоалифатический углеводородный остаток; ароматический углеводородный остаток; алкилоксигруппа с 1-17, предпочтительно 1-6, атомами С, или 50 бензилоксигруппа. R может обозначать нераэветвленную или разветвленную алкильную группу, например метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, гептил, октил и т.д. до гептадецила; бензильную 2-фенилэтильную, 3-фенилпропильную и т.д. до 11-фенилундецильной группы; циклогексильную или фенильную, ж - нафтильную, Р -нафтильную или бифенильную группу, а также бенэилоксигруппу. 60
R — сульфонильная группа — может представлять собой алкансульфонилгруппу, алкановый остаток которой содержит 1-17, предпочтительно 1-6„ атомов С, например метан- или этан30
Изобретение относится к медицине, а именно биологическим методам исследования биологических жидкостей.
Известен способ определения тромбина, плазмпна, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических 5 жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением продуктов гидролиза фотометрически, спектрометрически или флюорографически (1).
Однако известный способ недоста-. точно чувствителен.
Бель изобретения вЂ,повышение чувствительности способа.
Поставленная цель достигается тем,15 что согласно способу определения тромбина, плазмина, трипсина и тромбиноподобных ферментов в биологических жидкостях путем взаимодействия пробы биологической жидкости с субстратом с последующим определением про-20 дуктов гидролиза фотометрически, спек трометрически или флюоресцентноспектрофотометрически в качестве субстрата используют вещество общей Формулы.
1 2
R -гли-про-Х-NH-R (1) сульфонильную группу или арсульфонильную группу, ароматическое ядро которой может быть замещено одной или несколькими (например, тремя) алкильными группами, например бензолсульфонильную, и-толуолсульфонильную или нафталинсульфонильную группу.
R может представлять собой, например, п-нитрофенильную, 2-нафтильную или 4-метокси-2-нафтильную группу.
Субстрат можно получать различны-. ми известными методами, например, согласно одному из них связывают хромофорные группы (R в формуле 1) с С-концевой аминокислотной группой.
Эти группы одновременно имеют функцию С-концевых групп, защищающих карбоксильную группу во время ступенчатого соединения аминокислот при образовании желаемой пептидной цепи. Остальные защитные группы селективно отщепляют от целевого продукта беэ влияния на хромофорную группу.
Анализ элюатов и продуктов проводят путем тонкослойной хроматограФии.
Для этой цели применяют покрытые гелем двуокиси кремния Ф 254 стеклянные пластинки. Для проявления тонкослойных хроматограмм применяют следующие системы растворителей: хлороформ:метанол 9:1; н-пропанол:этиловый эфир уксусной кислоты, вода 7:1:2; н-бутанол:уксусная кислота; вода
3:1:1.
Хроматограммы проявляют сначала в ультрафиолетовом свете и потом путем реакции с хлором/толуидином.
Подгруппа определенных формулой I субстратов соответствует веществу, описанному следующей формулой
R -гли-про-apr-R (1 где R — алкилоксикарбонильная группа, алкилостаток которой содержит 1-6 атомов С, аралкилоксикарбонилгруппа, алкиленовый остаток которой содержит 1-6 атомов С, алкансульфонильная группа, алканостаток которой содержит
1-6 атомов С, арилсульфонилгруппа, арилостаток которой содержит в соответствующем случае заместители, или алкансильная группа, алканостаток которой содержит 1-6 атомов С;
R — h-нитрофенильная, 2-нафтильная или 4-метокси-2-нафтильная группа.
Субстраты этой формулы имеют высокую восприимчивость не только в отношении плаэмина и трипсина, а также и в отношении тромбина и тромбиноподобных энзимов.
Н р и м е р 1. N"-Кбо-гли-про-apr-пНА НСХ; кбо-арг-рНА НСХ.
1099839
В круглодонной трехгорлой колбе емкостью 250 мл Растворяют 16,0 г высушенного пятиокисью фосфора кбоарг-ОН НСЮ в 90 мл абсолютного ГМПТА (триамид N N, N, N, N " — гексаметилфосфорной кислоты) без доступа влаги при 20 С. К полученному раствору прибавляют при комнатной температуре сначала раствор 4,74 г триэтиламина н 10 мл ГМПТА и затем
16,4 г и-нитрофекилизоцианата (100%-ный избыток) по порциям.
После 24 ч при 20 С ГМПТА большей частью отгоняют в вакууме. Остаток экстрагируют неоднократно 30%-ной уксусной кислотой.. Остаток выбрасывают.
Соединенные экстракты уксусной кислоты для дальнейшей очистки наносят на.уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Г-15 и элюируют ЗОВ-ной уксусной кислотой. Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином при ос вобождении п-нитроанилина, подвергают сушке вымораживанием. Получают
l2,6 r аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм ме в системе растворителей В.
Элементный; анализ,%: С 51,2Э (51,67); Н 5,48 (5,42); N 17,,92 (18,08); Cf 7,50 (7,73).
С2о Н 5 Иь05СХ
П p e p N -Кбо-глк-про06
-apr-nHA НСХ.
4,65 г соединения примера 1 обрабатывают 40 мл 2 í. HBr в ледяной уксусной кислоте без доступа нлаги при перемешинакик в течение 1 ч при
20 С. Пептидное производное при этом
РаствоРяется прк выделении СО2. Реак-4 ционный раствор при сильном перемеши. нанни прибавляют по каплям к 250 мл абсолютного эфира, причем выпадает (2HBr) Н-apr-nHA. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают твердую фазу еще 4 раза, применяя по 45
100 мл абсолютного эфира, с целью удаления образовавшегося в качестве побочного продукта бензилбромида, а также избыток HBr и уксусной кислоты
Путем сушки в вакууме пластинками 50
NaOH получают деблокированный продукт с количественным выходом. Сухой (2HBr) Н-арг-РНА растворяют в 25 мл диметилформалида. К охлажденному до
-10 С раствору прибавляют 1,40 мл триэтиламина. Образуется осадок, который отфильтровывают и дополнительно промынают небольшим количеством холодного диметилформамида. К фильтрату прибавляют при -10 С 4,70 г о кбо-гли-про-п-нитрофенокси. Через 60 несколько часон температура реакцио онного раствора поднимается до 20 С. о
Раствор опять охлаждают до -10 С и буферуют 0,35 мл триэтиламина. Через
16 ч прибавляют е е Раз 0,35 и три 65 этилами<а при — 10"C. Еще через 24 ч концентрируют реакционный раствор в вакууме досуха. Остаток растворяют н
50 мл метанола. После прибавления
0,8 мл кон:::".трировакной соляной кис. лоты концентрируют раствор досуха н вакууме при. 20 С. Эту операцию повторяют 3 раза с целью перевода гид; робромида трипептида в гидрохлорид.
Сырой гидрохлорид трипептида растворяют в 50 мл метачола и предварительно счищают при помощи фильтрации гелем через колонку Сефадекс
ЛХ-20 .
Для дальнейшей очистки концентрируют н вакууме ту фракцию метанола, которую MQKHQ Расщеплять обработкой трипскном с освобождением n-. lèòðoанилкна. Остаток растворяют в ЗOЪ-ной уксусной кислоте. Раствор очищают путем фильтрации гелем на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефацекс Г-15 . Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-Hèòpoàíèëèна, после прибавления 0,80 мл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием. Получа ют 3,64 г (58,8% от теоретического) аморфного легкого порошка, который однороден н тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 52,09 (52,38); Н 5,83 (5,70); N 18,33 (18,10); С1 5,75 (5,73).
С-,Н 14 О СИ
Анализ дает аминокислоты в правильном соотношении: арг: 0,96-гли:
:1,00-про:0,96.
Г р и м е р 3. Н-Гли-про -арг-nHA 2НС2.
61,91 г полученного по примеру 2 соедкнечия без доступа влаги обрабатывают 300 мл 3 к.соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте с перемешиванием в течение 2 ч при 35 С
Пептидное производное при этом растворяется при выделении СО2.
Реакционный раствор при сильном перемешиваник прибавляют по каплям к
2 л абсолютного эфира, причем выпадает Н-гли-про-арг-пН-2НСХ в виде хлопьев. Эфирную фазу отсасывают, после чего промывают тнердую фазу еще
4 раза, применял по О, 5 л абсолютного эфира, с целью удаления образовавшегося в качестве продукта расщепления бензклхлорида и избытка соляной и уксусной кислот.
Путем сушки в вакууме плитками
ИаОН получают деблокированный продукт с количественным выходом. Для дальнейшей очистки растворяют высушеккый продукт в 900 мл ЗОВ-ной уксусной кислоты. Раствор очищают путем фильтрации гелем на уравновешенной ЗОВ-кой уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . При этом
3 09 3<339 разделяют злюат уксусной кислоты на 2 фракции, которые обе можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина.
Главная фракция содержит желаемый продукт, а побочная фракция — исходный материал. После прибавления
8 мл концентрированной соляной кислоты к главной фракции ее подвергаю сушке вымораживанием.
Получают 43,5 г аморфного порошка,)O который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей H.
Элементный анализ,Ъ: C 43,38 (43,77); Н 5,88 (5,80); N 21,72 (21,49); CZ 13,41 (13,60) .
С33Н д И8О СХ .
Пример 4. 2,09 г полученного соединения из примера 3 растворяют в
25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют
555 мкл триэтиламина и непосредствен 20 но после этого 1,13 г и-нитрофенилового эфира фенилуксусной кислоты.
Реакционный продукт обрабатывают, как описано выше.
Очистка. Фильтрацию гелем осущест-25 вляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксус ной кислотой колонке Сефадекс Г-15
Ту фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроани-30 лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвер гают сушке вымораживанием.
Выход 1,99 г (82,5Ъ от теоретическогo) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм- " ме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 54,06 (53,77); Н 5,78 (5,85); N 18,83 (18,58); СХ 5,79 (5,88) .
С у Н N60e С
4О
Пример 5. N"-Фенилпропионил-, -гли-про-арг-пНА.НСХ.
2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметил4ормамида. После охлаждения до — 10ОС прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,19 г и-нитрофенилового эфира 3-фенилпропионовой кислоты 50 (т.пл. 97-98,5 С). Продукт реакции обрабатывают, как описано выше. Филь трацию гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотной колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсиногл с выделением п-нитроанилина, после при бавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
6О
Выход 2,06 г (83,5Ъ от теоретического) аморфного порошка, который од:нороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей B.
Элементный анализ,Ъ: С 54.2 (54,50); Н 5,98 (6,04); N 18,29 ); (18,16); СХ 5,63 (5,75).
С,„Н„NgOe CX
OC
Пример 6. N -Циклогексилкарбонил-гли-про-арг-nHA HCI.
2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до
-10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,10 r n-нитрофенилового эфира циклогексикарбонсвой кислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.
Фильтрацию гелем осуществляют на уравновешенном ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию" элюата уксусной кислоты, можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 1,87 г (78,6Ъ о теоретического) аморфнсго порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 52,70 (52,47); Н 6,72 (6,61); N 19,03 (18,83); СР 5,83 (5,96).
С Н oNpиьСХ
Пример 7, N --Каприлоил-гли0(, -про-арг-пНА НС1.
2,09 г полую=-нного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл риметилформамида. После охлаждения до †10 прибавляют 555 мкл триэтиламина и непосредственно после этого
1.17 г и-нитрофенилового эфиракаприловой кислоты. Реакционный продукт обрабатывают, как описано выше.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять путем обработки трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления
320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 1,99 г (81,4Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограглме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 52,84 (53к06)„" Н 7кl5 (7 09) И 18к58
;18,34); Cl 5,73 (5,80).
С,„"<,Н4 И80г, СХ
Пример 8. N -Иоэ-гли-проОС
-арг-пНА НС2.
2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до
-10 С грибавляют 555 мкл триэтиламина и непосредственно после этого
840 i ë хлорангидрида и-толуолсульфоновой кислоты (тоэилхлорида). Про1099839 дукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной
30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 2,17 г (84,9Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растнорителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 48,50 (48,86);Н 5,60 (5,52); N 17,73 (17,53); S 5,19 (5,02); CY 5,49 (5, 55) .!
С „Н„ >,О,ВС р и м е Р 9. М -БензолсульК фонил-гли-про-арг-пНА HCI.
2,09 r полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до
-10 С прибавляют 555 мкл триэтилами- 25 на и после этого 780 мг хлорангидрида бензолсульфононой кислоты.
2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до
-10 С прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 345 мкл хлорангидри да метансульфоновой кислоты. Продукт реакции обрабатывают дальше, как описано выше.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, 60 которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Продукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой ко-. лонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке нымораживанием.
Выход 1,95 г (78Ъ от теоретического) аморфного порошка, который 40 однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ, %: С 47,79 (48,03); Н 5,40 (5,32); N 18,11 (17,93); S 5,06 (5,13); Cf 5,61(5,67)45
С < Н gg N8Oz SC
Пример 10. N -Метансульфонил-гли-про-арr-пНА НСЫ.
Выход 1,70 г (75,5Ъ от теор..тического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме н сис-еме растворителей В.
Элементньй анализ,Ъ: С 42, 88 (42,66)> Н 5>63(5,55); N 20,08 (19,90) > S 5,62 (5,70); СЫ 6,21 (6, 30), С и> Н, N>> O y S C f
Пример 11. Б -2-НафталинМ сульфонил-гли-про-арг-nHA ° НC f.
2, 09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С прибавляют 555 мкл триэтил0 амина и после этого 1, 0 г хлорангидрида нафталин -2-сульфоновой кислоты
Продукт реакции обрабатывают, как описано выше.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной ЗOЪ-ной уксусйой кислотой колонке Càôàäåêñ Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроани лина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход, 1,81 r (66,8Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ- С 51,88 (51,59); Н 5,19 (5,23); N 16,75 (16,60); Я 4,62 (4,75); СХ 5,12 (5,25) .
С Н ИзО БСЙ
II р и м е р 12. N -Изобутилоксикарбонил-гли-про-арг-пНА.НС2.
2,09 г полученного по примеру 3 соединения растворяют в 25 мл диметилформамида. После охлаждения до
-10 С прибанляют 555 мкл триэтиламина и после этого 650 мкл изобутило- ного эфира хлормураньиной кислоты.
Реакционный продукт перерабатыгают дальше, как бписано ныае.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной
:кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 1,71 (73,1Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 49,06 (49,27); Н 6,42 (6,37); М 19,33 (l9 15); СК 5, 98 (6, 06) .
Спр Н > Х Оу СХ
Пример 13. N -Кбо-гли-про-apr-2-HA HCI; N -кбо-арг (NOg ) -2-HA.
1099839
3,53 г хорошо высушенного кбо-арг (N0 )-OH без доступа влаги растворяют в 150 мл тетрагидрофурана/диметилформамида (3:1). После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют
1,39 мл триэтиламина и потом по капг лям в течение 15 мин раствор 1,35 г изобутилового эфира хлормуравьиной кислоты в 20 мл тетрагидрофурана, причем температуру выдерживают от
-10 до -5 С. К полученному раствору и 0 затем прибавляют по каплям раствор
1,72 r п-нафтиламина в 15 мл тетрагидрофурана, причем поддерживают указанную температуру. Реакционную смесь составляют стоять н течение 15
24 ч при комнатной температуре. После отгонки растворителя в вакууме промывают остаток подряд три раза дистиллированной водой, три раза
5%-ным раствором гидрогенкарбоната
20 натрия и опять три раза дистиллированной водой. После сушки н вакууме растворяют сырой продукт в метаноле и хроматографируют через ураннонешенную метанолом колонку Сефадекс
ЛХ-20 ° Из одной фракции элюата получают 3,75 г кристаллического
OC соединения Н -кбо-арг-(ИО ) -2-НА (78,4Ъ от теоретического) с т.пл.
173-174,5 С, которое однородно н
О тонкослойной хроматограмме в систе-. мах растворителей А и Б.
Элементный анализ,Ъ: С 60,82 (60,24); Н 5,63/ (5,48); N 17,48 ,(16,72).
3 )
С„Н „. 1 О, Пример 14. Н-арг-2-НА HCI.
957 мг соединения N -кбо-арг(NOg) †2-, -НА навешивают в реакционном сосуде аппарата Сакакибара. 15 мл высушенного фтористоводородного газа конден-40 сируют в реакционном сосуде. После реакции через 1 ч при 0 С при перемешивании отщепляют нитрозащитную группу аргинина, а также карбобензоксигруппу. Конденсированный фтористоно- 4 . дородный газ отгоняют в вакууме из реакционной смеси и остаток растворяют в диметилформамиде. для перевода производного аминокислоты н солянокислую соль прибавляют 0,5 мл концентрированной соляной кислоты и раствор концентрируют досуха. После днукратного повторения . этого процесса растворяют остаток в 50 мл 40%-ной уксусной кислоты. Дляочистки наносят раствор уксусной кислоты на уравновешенную 30%-ной уксусной кислотой колонку Сефадекс Г-15 и элюируют 30%-ной уксусной кислотой. Фракцию элюата, которую можно 60 расщеплять обработкой трипсином с освобождением п-нитроанилина, после прибавления 320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 4 73 мг (63,5% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограм. ме н системе растворителей B.
Элементный анализ, %:
С 51, 82 (51, 62); Н 6, 18 (6, 23);
N 17, 08 (18, 81); Cl 18, 75 (19, 05) .
С,g Hgg NgOC @
Пример 15. N -Кбо-гли-проapr-2-HA HC1..
372 мг соединения по примеру 14 подвергают взаимодействию с 470 мг кбо-гли-гро-ОпНП, получая соединения
N -кбо-гли-арг-2-НА НС1 Фильтронани
1» гелем осуществляют на уравновешенной уксусной кислотой колонке Сефадекс
Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением инафтиламина, после прибавления
80 мкл концентрированной со 1яной кислоты подвергают сушке ныморажинанием.
Выход 425 мг (68,1% от теоретического) аморфного порошка, который однброден н тонкослойной хроматограмме в системе растворителей B.
Элементный анализ,Ъ: С 60,11 (59,65); Н 6,25 (6,14), N 16,07 (15,! 1); .CZ 5, 59 (5, 68) .
С )< Ньз NyOqC1П р и м е p lo. N -Гли-про-арг,— 2-HA HCI.
625 мг соединения N -кбо-гли-про1
-арг-2-НА.НСХ деблокируют, как описано выше, и растворяют в 8 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 14 0 мкл триэтило амина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфононой кислоты(т.пл.
67-69"С) . Реакционный продукт обрабатывают известными приемами.
Фильтрование гелем осуществляют на уравнонешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением Р -нафтиламина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 500 мг аморфного порошка.
Элементный анализ,Ъ: С 56,13 (55,93); Н 5,86 (5,95); N 15,48 (15,?2); S 5,07 (4,98); CZ 5,39 (5, 50) .
Пример 17. N -Кбо-гли-про-арг-4-NeO-2-НА. НСУ1 N -кбо-арг
К (Ю ) -4-Мео-2-hA.
3, 53 г кбо-apr(NO< ) -ОН согласно примеру 13 подвергают взаимодеистнию с 2,17 г 4-метокси-2-нафтиламина и перерабатывают, как описано в этом примере. Фильтрование гелем осущестнляют на уранновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ 20 .
Из одной фракции элюата получают
3,35 г (65,9% ст теоретического) 1099839
35 кристаллического соединения N êáoapr(NO<) 4-Ме0-2-НА, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей А и Б.
Элементный анализ,Ъ: С 59,18 (59,05); H 5,43 (5,55); N 16,49 (16,23) .
С„Н„N&O6
Пример 18. Н-Apr-4-Мео-2-НА 2НС2.
1, 02 г соединения N -кбо-apr (NOq) -10
К
-4-МеО-2-НА подвергают взаимодействию получая соединение Н-apr-4-МеО-2-НА 2НС2.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешеннсй 30%-ной уксусной 15 кисло ой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтиламина, после прибавления
320 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вы ораживанием.
Выход 570 мг (71,0Ъ от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хромато грамме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 51,08 (50 88); Н 5 98 (б 03); N 17 75 (17,45); CI 17,55 (17,67).
С <, Н„),О,СЫ
Пример 19. 402 мг соединения H-арг-4-МеО-2-HA НСХ подвергают взаимодействию с 470 мг кбо-гли-про-ОпНП, получая соединение N -кбо ( — гли-про-арг-4-МеО-2-HA. HCХ.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой 40 трипсином с освобождением 4-метокси2-нафтиламина, после прибавления
80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 493 мг (75,4Ъ от теоретичес-45 кого) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,Ъ: С 59,01 (58,75); Н 6,10 (6,16); N 15,19 ..50 (l4,99); Cl 5,35 (5,42).
Пример 20. 655 мг соединения Ф-кбо-гли-про-арг-4-МеО-2-HA 55
HCI деблокируют и растворяют в 80 мл диметилформалина. После охлаждения до -10ОС прибавляют 140 мкл триэтилалина и после этого 210 мг хлорангидрида и-толуолсульфоновой кислоты.
Продукт реакции перерабатывают даль- 60 ше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30%-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтиламина, после прибавления
80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживаниPM.
Выход 465 мг (69,4% от теоретического) аморфного порошка, который однороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Элементный анализ,%: С 55,7 5 (55,72); Н 6,01 (5,98); N 14,98 (14,54); S 4,59 (4,76); CI 5,16 (5,26} .
Cq) Нло N7О SCX
Пример 21. N -Моз-гли-пролиз-пНА НСР;
N-БОК-N -кбо-лиз-пНА. т
19, 0 г соединения N ÁOÊ-N -кбо-лиэ-ОН растворяют в 100 мл ГМПТА и прибавляют 5,06 г триэтиламина и потом 16,4 г п-нитрофенилизоцианата.
По истечении 24 ч реакционный раствор с перемешиванием прибавляют
1 по каплям к 1 л 2Ъ-ного раствора гидрогенкарбоната натрия. Осажден-. ный продукт отфильтровывают и промывают трижды по 0,5 2%-ного раствора гидрогенкарбоната натрия, трижды по 0,5 л дистиллированной воды, трижды по 0,5 0,5 н. соляной кислоты и трижды по 0,5 л дистиллированной воды. Полученный продукт высуши-. о вают в вакууме при 40 С и после этого зкстрагируют дважды, применяя по 30 мл нагретого до 70 С диметилформамида, причем желаемый продукт полностью растворяется, в то время как побочный продукт, NN -бис-и-яитI рофенилмочевина, остается в нерастворенном виде. Раствор диметилформамида конц нтрируют в вакууме пРи 40 С.
Остаток растворяют в метаноле и путем фильтрования гелем через урав\ I новешенную метанолом колонку Сефадекс ЛХ-20 получают 18,85 (75,3% от теоретического) кристаллического соединения N"-EOK-Ф-кбо-лиз-пНА с т.пл. 125-.125,5 С, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей А и В .
Элементный анализ,Ъ: С 60,49 (59, 99); Н 6, 35 (6, 44); N 11, 48 (11, 19) .
С „- Н 1 N
Пример 22. N -Моз-гли- про-лиз E — кбо) -пНА.
1, 5 г соединения N -БОК-N -кбо-лиз-пНА обрабатывают, перемешивая
1 ч при 20 С, 20 мл трифторуксусной кислоты без доступа влаги, причем производное аминокислоты растворяется с выделением СО . Реакционный раствор при сильном перемешивании медленно прибавляют по каплям к
150 мл высушенного эфира, причем выпадает Н-лиз (C-кбо)-пНА-трифторацетат, Эфирную фазу отсасывают фильтровальной палкой. Оставшийся
1099839 осадок промывают еще 4 раза, применяя по 50 мл сухого эфира для удаления избыточной трифторуксусной кислоты. Сушкой в вакууме плитками едкого натра получают деблокиронанный продукт с количественным выходом. Сухой трифторацетат производного аминокислоты растворяют н 15 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 C прибавляют к раствору
415 мкл триэтиламина для освобожде- 1О ния произнодного аминокислоты из трифторацетата. К реакционной смеси прибавляют 1,48 г моз-гли-про-ОпНП.
Продукт реакции перерабатывают дальше, как описано выше. Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс
ЛХ-20 .
Выход 1,77 г (83.2-о от теоретичесcoro) аморфного вещества, которое однородно в тонкослойной хроматограмме и системах растворителей А и
Б. и, Пример 23. N -Моз-гли-npo-JIN3-пНА HCI. 25
1,42 г соединения N -моз-гли--про-лиз(Е-кбо) -пНА деблокируют.
Фильтрование гелем осущестнляют на
;;:ðàâíîâåøåííîé 30Ъ-ной уксусной кио.лстой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, .оторую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением и-, HHTpo анилина, после прибавления 160 мкл концентр:рованной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 1040 мг (85,1Ъ от теорети-ческого) аморфного порошка, которь1й однороден н тонкослойной хроматограъме н системе растворителей В.
Пример 24. М -Изобутокси- 40 карбонил-гли-про-лиз — nНА НСХ„ N
БОК-гли-про-лиз-(Е-кбо)-nI!A.
20 г соединения N -БОК-N -кбоcL Е
-лиз.-(c..-кбо)-пНА деблокируют и раст-воряют н 20 мл диметилформамида.
После охлаждения до — 10 C к раствору прибавляют 555 мкл триэтиламина и после этого 1,73 г ВОК-гли-про-О. НП, Реакционный продукт перерабатывают, как описано выше. Фильтрование гелем осущестнляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .
Выход 2,20 г 84,0Ъ от теоретического)аморфного вещества, которое однородно н тонкослойной хроматограмме н системах растворителей А и Б.
Пример 25.)(-Изобутоксикарбонил-гли-про-лиз (E.-кбо) -л HA
1,31 г соединения Ч".-БОК-гли-про-лиз(Я-кбо) -пНА деблокируют и раство-6() ряют н 12 мл диметилформамида. После охлаждения до -10вC к раствору при-бавляют 280 мкл триэтиламина и после этого 285 мкл изобутилоного эфира хлормуравьиной кислоты. Продукт 65 реакции обрабатывают, как описано ныше., Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .
Выход 1,15 r (87,8Ъ от теоретического)аморфного вещества, которое однородно и тонкослойной хроматограмме н системах растворителей А и Б.
Пример 26. " -Изобутоксикарй, бонил-гли-про-лиз-иНА. HC J.
660 мг соединения N -изобутоксикарбонил-гли-про-лиз (Е-кбо) -к HA деблокируют. Фильтронание гелем осущестнляют на ураннонешенной 30Ъ-ной уксусной кислоты колонке Сефадекс
Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением r нитроанилина, после прибавления
80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 430 мг (77,2o- от теоретического)аморфного порошка, который однороден и тонкослойной хроматограмМе в системе растворителей В.
Пример 27. Ф -Моз-гли-про-лиз-2-HA ° НСХ; И" -БОК-М кбо-rIva-2-HA
1,90 г соединения N -БОК-N †кбо-лиз-OH поднер,ают взаимодействию, как указано при получении Ы -кбо-арг-(NOq)-2-НА., получая соединения
N -БОК-N -кбо-лиз-2-HA.
Фильтрование гелем осуществляют на уравнонешенной метанолом колонке " Сефадекс ЛХ-20 .
Выход 1,60 r,63,3Ъ от теоретического) аморфного соединения, которое однородно н тонкослойной хроматограмме н системах растворителей и Б.
Пример 28. I< -Моз-гли-про-лиз(Е-кбо) -2-НА, 1,0з г соединения " -БОК- -кбоГ
Ф
-лиз — 2-НА деблокируют, как указано при получении Й -моз-гли-пролиз-(Е -кбо)-пНА„ и растворяют в
20 мл диметилформамида. После охлаждения до -10 С к раствору прибавляют 280 мкл триэтиламина и непосредственно после этого 985 мг моз-гли-про-ОпНП. Продукт реакции перерабатывают дальше,, как указано выше.
Фильтрование гелем осущестнляют на уравновешенной метанолом колонке
" Сефадекс ЛХ-20 . Выход 1, r аморфного вещества, которое однород-
Но в тонкослойной хроматограмме.
Пример 29. И -моз-гли-про 6
-лиз-"-HA.HCZ.
715 мг соединения N -моз-гли †проК
-лиз (E-кбо) -2-НА деблокируют, как указано выше.
Фильтрование гелем осуществляют на уравновешенной 30Ъ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 .
Фракцию элюата уксусной кислоты, ко-.îðóM можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 2-нафтил!
099839 амина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 470 мг (76,3Ъ от теоретичес кого)аморфного порошка, который одно-. роден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Пример 30. N -Моз-гли-про-лив,-4-Ме0-2НА НСР; « -БОК- NE-кбоК
-лиз-4- le0-2-HA.
1,90 r соединения > -БОК- -кбо<< Е
-лиз-ОН подвергают взаимодействию с
1,22 r 4-метокси-2-нафтиламина согласно примеру 13.
Фильтрование гелем осуществляют на уравнове", енной метанолом колонке 15 Сефадекс ЛХ-20 .
Выход 1,82 r (168,0Ъ от теоретического) аморфного соединения, которое однородно в тонкослойной хроматограмме в системах растворителей.
Пример 31.}(« -Моз-гли †про-лиз (E-кбо) -4-Ме0-2-НА.
1,07 г соединения }(-БОК- N -кбо-, -лиз-4-МеО-2-НА деблокируют согласно примеру 18 и рас гворяют в 20 мл диметилформамида. После охлаждения до — 10 С к раствору прибавляют 280 мкл триэтиламина и после этого 985 мг моз-гли-про-ОоНБ. Реакционный продукт перерабатывают согласно примеру 1.
Фильтрование гелем осуществляют 30 на уравногешенной метанолом колонке Сефадекс ЛХ-20 .
Выход 895 мг (60,2Ъ от теоретического) аморфного вещества, которое однородно в тонкослойной хроматограм-35 ме в системах растворителей.
Пример 32. N -Моз-гли-просс.
-лиз-4-МеО-2-HA HC E.
745 мг соединения по гримеру 31 деблокируют, как указано выше. Филь- 4О трование гелем осуществляют на уравновешенной ЗОЪ-ной уксусной кислотой колонке Сефадекс Г-15 . Фракцию элюата уксусной кислоты, которую можно расщеплять обработкой трипсином с освобождением 4-метокси-2-нафтил- 45 амина, после прибавления 80 мкл концентрированной соляной кислоты подвергают сушке вымораживанием.
Выход 470 мг (72,7Ъ от теоретичес. кого) аморфного порошка, который од- 59 нороден в тонкослойной хроматограмме в системе растворителей В.
Субстраты формулы 1 пригодны для определения энзимов, расщепляющих пептидные цепи на карбоксильной сто- 55 роне как аргинина, так и лизина.
К этой группе энзимов относятся тромбчн и тромбиноподобные энзимы, экаритромбин, плазмин и трипсин. При помощи субстратов можно также опреде- Я} лять проэнзимы, например протромбин, плазминоген и трипсиноген, активаторы и ингибиторы энзимов, например антитромбины, в частности софактор гепарина (антитромбин III) и гепарин далес антиплазмин <л.; -макроглобулин), ингибиторы трипсина (.,-антитрипсин), апротинин, ингибиторы трипсина соевых бобов и ингибиторы плазмина.
При полн,.л активиров< нии проэнзи-< мон активаторами или с лесями активаторов образуется эквивалентное количе:.тво энзима, которое можно измерять.
Измерение концентрации активаторов проводят таким образом, что определяют скорость образования энзима из проэнзима. Эта скорость пропорциональна концентрации активатора.
Пример 33. Субстрат, например < -кбо-гли-про-арг- HA НСР, при"
5 меняют для определения различных энзимов в плазме крови.
Определение основывается на.том принципе, что образованный ферментативным гидролизом субстрата продукт расщепления ИН вЂ - P имеет УФ-спектр, который отличается от УФ -спектра, субстрата и смещен в направлении больших длин волн. Так, субстрат <4 --кбо-гли-про-арг-РНА НСР имеет максимум поглощения при 302 нм и молярный коэффициент экстинкции 12920. Поглощение субстрата при 405 нм практически равно О.
Образованный при ферментативном гидролизе субстрата продукт расщепления NH,, R,, т.e. n-нитроанилин, имеет максимум йоглощения 380 нм и молярный ко: ффициент экстинкции 13200. При
405 нм коэффициент экстинкции мало понижается, т.е. до 9650. Путем спектрофотометрического измерения при 405 нм можно легко определять степень ферментативного гидролиза субс=рата, которая пропорциональна количеству о=щепленного и-нитроанилина.
Имеющийся в избытке субстрат не мешает измерению при 405 нм. Спектрофотометрическое измерение во всех слу ta"х проводят при 405 нм.
Повышенная водорастворимость соединения обеспечивает определение энзимов в более широких пределах концентрации. Это важно при стандартных способах исследования, так как в этих случаях можно точно определять крайние величины, без предварительного разбавления или концентрирования биологических проб.
Измерени