Способ определения сульфгидрильных групп в клетках крови

Способ определения сульфгидрильных групп в клетках крови

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП В КЛЕТКАХ КРОВИ путем добавления к ним индикатора, отличающийся тем, что, с целью определения сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови, определяют скорость перемещения клеток крови в постоянном электрическом поле, до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концент)ации 0,600 ,65 10Зм и количество сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови (N) определяют по формуле N 6.48-10 --

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

NMI

РЕСПУБЛИК

ЭЬ9 С 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OfНРЫТИЙ (21) 3462881/28-13 (22) 02.07.82 (46) 07.07.84. Бюл. Ф 25 (72) В.М.Денисов и Н.В.Фадеева (71) Горьковский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии .(53) 591.111 (088.8) (56) 1. Золотницкая P.Ï. Сульфгидрильные группы. "Справочник по клиническим лабораторным методам исследования". Под ред. Кост Е.А. М., 1975, с. 179. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП В КЛЕТКАХ КРОВИ путем добавления к ним индикатора, отличающийся тем, что, с целью определения сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови, определяют скорость перемещения клеток крови в постоянном электрическом поле до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концентрации 0,60,SU„, 11 9 . A

0,65 ° 10 3М и количество сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови (Н) определяют по формуле

N = 6,48 -10 Ч (V> — Ч ), где L — длина измерительной ячейки, см;

Ч вЂ” разность потенциалов на концах ячейки, В; V скорость, с которой исследуемая клетка перемещается в постоянном электрическом поле до добавления раствора двухлористой ртути, мкм/с, \

V — скорость с которой иссле2

Э дуемая клетка перемещается в постоянном электрическом поле после добавления раствора двухлористой ртути, мкм/с, а — радиус исследуемой клетки, мкм.

1 1101

Изобретение относится к области медицинской биохимии, а именно к определению сульфгидрильных групп в клетках крови.

Известен способ определения сульф5 гидрильных групп в клетках крови путем добавления к ним индикатора j1 3. .Однако этот способ выявляет лишь внутриклеточно расположенные сульфгидрильные группы и носит качествен ный характер.

Цель изобретения — определение сульфгидрильных групп на поверхности мембран клеток крови.

Эта цель достигается тем, что со15 гласно способу определения сульфгидрильных групп в клетках крови путем добавления к ним индикатора, определяют скорость перемещения клеток кро20 ви в постоянном электрическом поле до и после добавления к ним раствора двухлористой ртути в конечной концентрации 0,60-0,65 . 10 3Ì и количество сульфгидрильных групп на поверх25 ности мембран клеток крови (N) определяют по формуле

И = 6,48 -10 . (Ч2 — Ч„), где I. — длина измерительной ячейки, см;

V - разность потенциалов на концах ячейки, В;

V - скорость, с которой исследуемая клетка перемещается в постоянном электрическом поле до добавления раствора двухлористой ртути, мкм/с, 72 — скорость, с которой исследуемая клетка перемещается @ в постоянном электрическом поле после добавления раствора двухлористой ртути, мкм/с; а — радиус исследуемой клетки, мкм.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Венозную кровь стабилизируют в пробирке 3,87-ным раствором цитрата натрия в соотношении 4:1. Определяют содержание эритроцитов и гематокрит стандартными методами. Эритроциты осаждают центрифугированием крови при 1000 об/мин в течение 10-12 мин. Ы

Плазма отделяется. Осажденные эритроциты разливают в две центрифужные пробирки по 0,5 мл. К ним добавляют

?39 2 по 5 мл буфера Михаэлиса. После перемешивания смесь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость удаляют.В первую пробирку добавляют 0,25 мл

0,97.-ного раствора хлористого натрия (контроль), во вторую — 0,25 мл

0,62 ° 10 M раствора двухлористой

-3 ртути на 0,97-ном растворе хлористого натрия (опыт). После перемешивания смесь инкубируют 3-4 мин при комнатной температуре. После этого эритроциты отмывают буфером Михаэлиса. Из отмытых эритроцитов 0,02 мл разводят в 500 раз буфером Михаэлиса и используют для определения эиектрофоретической подвижности стандартным методом.

Содержание сульфгидрильных групп рассчитывается по вышеприведенной формуле.

Пример. В пробирку, содержащую 1 мл 3,8Х-ного раствора .цитрата натрия, добавляют 4 мл венозной крови больного. После перемешивания определяют содержание в ней эритроцитов и гематокрит. В данном случае они равняются 3,5 10ь в 1 мм и

387 соответственно. После центрифугирования крови при 1000 об/мин в течение 12 мин отделившаяся плазма удаляется. Осевшие эритроциты разливают в две пробирки по 0,5 мл, к ним добавляют по 5 мп буфера Михаэлиса. После перемешивания и центрифугирования в течение 10 мин надосадочную жидкость удаляют, а к эритроцитам в первой пробирке добавляют 0,25 мл 0,9Х-ного раствора хлористого натрия, а во второй

0,25 мп 0,62 ° 103Ì раствора двухлористой ртути на 0,97.-ном растворе хлористого натрия. После перемешивания и выдерживания при комнатной температуре эритроциты в обеих пробирках отмывают буфером Михаэлиса. Из обеих пробирок по 0,02 мл эритроцитов переносят в пробирки с- 10 мл буфера.

Полученную взвесь используют для определения скорости перемешивания эритроцитов в электрическом поле.

Определяют время, за которое клетки переместятся на расстояние 43 мкм.

Для контрольных эритроцитов оно равнялось 3,28 с, для опьгта — 2,84 с (среднее время из 20 измерений).

Значение остальных параметров, входящих в формулу расчета для данных усСоставитель Е.Житникова

Техред C. Мигунова Корректор А.Ильин

Редактор Н.Данкулич

Заказ 4756/28 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 11017 ловий, равно: а - 3,6 мкм, Ь вЂ” 4 см, V — 25 В.

Отсюда содержание сульфгидрильных групп в исследованных эритроцитах равно 27,2 1О

Ь

Предлагаемый способ используют для исследования эритроцитов донорской и фибринолизной крови. Содержание сульфгидрильных групп на мембранах донорских эритроцитов 20,1+ 1О

+1,05 ° 10", фибринолизных эритроцитов — 20,4+0,89 ° 10

В процессе хранения крови содержание свободных сульфгидрильных групп на поверхности цитоплаэматической мембраны донорских эритроцитов снижается и равняется через 7 сут

10,8+0,91 10

Предлагаемый способ используют ?О для определения содержания сульфгид39 4 рильных групп в тромбоцитах. Установлено, что в тромбоцитах донорской крови оно равно 4,37+0.,51 ° 10Ь.

В процессе хранения вьщеленных тромбоцитов при 4 С содержание сульфгндрильных групп на мембранах тромбоцитов быстро уменьшается и через трое суток равняется 0,67+0, 17 ° !ОЬ.

Содержание сульфгидрильных групп на поверхности лимфоцитов, вьщеленных из фибринолизной крови, равняется 18,64 2,07 10 .

Предлагаемый способ позволяет количественно определить изменение содержания сульфгидрипьных групп на поверхности мембран клеток крови, что отражает изменение биологической активности последних в процессе хранения и открывает новые перспективы для совершенствования .способов консервирования клеток крови.