Способ получения фосфолипазы @

Способ получения фосфолипазы @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А,, включающий гомогенизирование животной ткани, экстрацию, под кисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку, отличающийсятем, что, с целью получения продукта, свободного от прго1есей лиэофосфолипаэы, в качестве животной ткани используют кишечник Urechis unicinctus, а экстракт перед подкислением подвергают термообработке при 45-55 С в течение 5-10 мин. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хроматографическую очистку проводят на диэтиламиноСП этилцеллюлозе и карбоксиметилцеллюлозе .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕаЪБЛИН

ОЮ ОИ {д) С 12 М 9/16

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОУСНОМУ CBWIETRllhCTEV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3489006/28-13 (22} 08.09.82 (46) 30.07.84. Бюл. У 28 (72) 3.С.Евтушенко и С.Н.Лукьянова (71) Институт биологии моря Дальневосточного научного центра АН СССР (53} 577. 15(088.8) (56) 1. Scandella С.I., Kornbug А.

"А membrane — bound phospholipase A1 рпгаfied from Е. coli, "Biochemistry, 1971, v. 10, В 24, 4447-4456.

2. Уап den Bash Н., Aarsman А.F., van Dcenen Ь.L. И., Isolation and ргорегйхез of à phospholipase А<

activity from beef pancreas", Biochim. Biophys. Acta, 1974, 348, 197209. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ А, включающий гомогенизирование животной ткани, зкстрацию, под кисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку, отличающийся тем, что, с целью получения продукта, свобод", ного от примесей лизофосфолипазы, в качестве животной ткани используют кишечник Urechis unicinctus, а экстракт перед подкислением подвергают термообработке при 45-55 С в течение

5-10 мин.

2. Способ по п. 1 о т л и ч а юшийся тем, что хроматографичес- Е кую очистку проводят на диэтиламино.этилцеллюлозе и карбоксиметилцеллюлозе.

С:

1 11055

Ф

Изобретение относится к способам выделения биологически активных соединений из природных источников, а именно к способам получения липолитического фермента-фосфолипазы А1 (фосфатид-1-ацилгидролазы КФ 3. 1. 1.4) .

Известен способ получения фосфолипазы А Ecsherichia coli )1) .

Однако при этом очищенный фермент наряду с фосфолипазной актив- 1О ностью обладает высокой лизофосфолипазной активностью.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения фосфолипазы А1, вклю чающий гомогенизированйе животной ткани (поджелудочной, железы быка), подкисление экстракта до рН 5,0, осаждение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку обычно на карбоксиметилцеллюлозе $23 .

Недостатками известного способа являются загрязнение целевого.продукта лизофосфолнпазой, а также миогостадийность и длительность процесса выделения.

Целью изобретения является получение продукта, свободного от примесей лизофосфолипазы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фос" фолипазы А1 „ включающему гомогени:зирование жйвотной ткани, экстракцию,.

::подкисление экстракта до рН 5,0, осаж-E.

3 дение целевого продукта сульфатом аммония и хроматографическую очистку, в качестве животной ткани используют кишечник Urechis unicinctus, а экстракт перед подкислением подвергают термообработке при 45-55 С в те" чение 5-10 мин.

Предпочтительно хроматографичес" кую очистку проводят на диэтиламиноэтилцеллюлозе и карбоксиметилцеллю-, 45 лозе.

В качестве животной ткани используется кишечник Urechis unicinctus, встречающийся в морях Дальнего.Востока и являющийся доступным сырьем, 50

Благодаря использованию термообработки гомогената достигается инактива- ция протеиназ, выпадение в осадок балластных белков и повышение удельной активности целевого продукта. 55

Нагревание необходимо проводить о при температуре 45-55 С в течение

5-10 мин.

02 2

При более низкой температуре не все балластные белки выпадают в осадок, а повышение температуры приводит к инактивацни фермента. Это же относится и к интервалу времени.

Пример. Для получения фосфолипазы А предлагаемым способом берут кишечник от трех животных (100 r), гомогенизируют в трех. объемах 0,05 М трмс -HCf буфера и центрифугируют при 16000 в течение

30 мин, осадок отбрасывают, супернатант прогревают при 50 С 5 мин оставляют в холодильнике на несколько часов и центрифугируют при 16000

30 мин. Осадок отбрасывают, супернатант при энергичном помешивании доводят 4N НС2 до рН 5,0,, оставляют на

2 ч в холодильнике и центрифугируют. рН супернанта доводят кристаллическим оксиметил-аминометаном (Трис ) до рН 7,5. К супернатанту добавляют твердого сульфата аммония до 0,4 насыщения и оставляют на ночь в холодильнике. После центрифугирования осадок растворяют в 5 мл 0,05 М срис -HCf буфера рН 7,5. После дийлиза раствор фермента наносят на колонку ДЕАЕ-целлюлозой. Размеры колонки: длина 15 см, диаметр 2,5 см, элюция сначала 0,05М

;Tptc-HC t буфером, затем ступенчатым градиентом 0,03 M NaC1 в том же буфере, скорость элюции 36 мл/ч, объем собираемых фракций 5 мл. Определение фосфолипазной активности проведено инкубацией субстрата 14С-фосфатидилI холина с исследуемым ферментным препаратом непосредственно на тонкослойной пластине с SiOg над влажной камерой в течение 30 мин, последующим высушиванием пластинки при 70 С о в течение 5 мин, разделением хроматограммы в системе хлороформ-метанол-аммиак (65-35-5) и обнаружением продуктов реакции парами иода. Количественное определение активности проводят, замеряя 14С-активность продуктов реакции на спектрометре Sutertechnique SI.-30.

Белковые фракции с максимальной фосфолипазной активностью объединяют и отдиализовывают против 0,02 М ацетатного буфера рН 5,6. Белок в диализате концентрируют добавкой сухого акрилекса P-2 с последующим отделением набухшего акрилекса центрифугированием при 3000g в течение

10 мин. Раствор 48 мг фермента в

1105502

Таблица

Схема очистки фосфолипазы А1 из кнюечника

Urechis unicinctus

С гелен очистк

Общий белок, мг бщая актив ость, мкм, ФХ

Сдатия очистки елъиая тивност и, ФХ/м белка

2608,0

0 52

5016

Исходный гомогенат о

Прогревание при 50

2304 1912,0

0,83

19 3

3,3

1663,0

385, 8

210, 1

2,8

5,3

2 75

140

0,96

48,2

0,36

3 53

65,1

18,4

0,28

2 54

36,4

14,3

20,31

0,17

39,0

174,7

8,6

%., j, ÔX — фос фаткдилх олин

5 мл 0,02 М ацетатного буфера рН S 6 загружают на колонку KN-целлюлозы (длина 10 см, диаметр 2,5 см, скорость элюции 30 мл/ч, элюция 0,02 M ацетатным буфером рН 5,6., затем ступенчатым градиентом 0-6,3 М NsCl в том ке буферф Активный ник фермента собирают и концентрируют акрилексом как описано вние. Все процедувы

10 но очистке фермента на колонках проводят нри температуре .6оС.

Использование предлагаемого способа позволяет выделить фосфолипазу А очищенную в 39 раэ по сравнению с исходным гомогенатом,и получить фермент, обладающий только фосфоПодкисление до рН 5,0

Осамдение (NH4 2SOi

ДЕАЕ-целлюлоза,1 пик

ДЕАЕ-целлюлоза If пик

ДЕАЕ-целлюлоз а 111пик

КМ-целлюлоза липаэной А1 активностью без примеси лиэофосфолнпазые ПредлагаемВФ споееб обеспечивает ииактивацию протеаз, выпадение в осадок балластюпс белков и повыаение удельной активности фосфолипазы А благодаря использованию на первой стадии очистки нровувэйния гомогената щж 50 С в течение

5 мин.

Применение нового вида сырья позволяет получать фосфолипазу А как биохимический препарат для научных целей при исследовании биологических мембран и в синтезе фосфолвшидов и их производных. f105502

Т а б л и ц а 2

Лизофосфолипазная активность препаратов при выделении фосфолипаэы А1

Стадия очистки

81

Подкисление до рН 5,0

Осаждение (NH g) SO4

ДЕАЕ-целлюлоза I пик

КМ-целлюлоза

Определение негидролизоваваегося лизофосфатидилхолина, в мкг фосфора, {лизоФХ - лизофосфатидилхолии) .

Составитель В.Муронец

Техред М.Гергель Корректор A.Ôåðåíö

Редактор Л.Повхан

Заказ 5544/19 Тирек 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.уигород, ул.Проектная, 4

Исходный гомогенат

Прогревание при 5О С

Определение с 2-ацилизо ФХ, 7 гидролиза