Способ получения эндонуклеазы рестрикции @ 1

Способ получения эндонуклеазы рестрикции @ 1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ М spt, включающий разрушение биомассы в присутствии детергента , фракционирование полученного лизата центрифугированием, хроматографию и диализ, отличающийс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, разрушение клеток проводят смесью лизоцима и тритона XI00

СОЮЗ СОБЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11>

З(51) С 12 Н 9/16

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3526165/28-13 (22) 20.12.82 (46) 15.08 ° 84. Бюл. 9 .30 (72) H.A.×èêàåâ, Ю.С.Ничаев, С.Ç.гинсберга и М.Я.Хейслере (53) 577.1 (088.8) (56) 1.Альбертсон П.О. Разделение клеточных частиц и макромолекул.

М,, Мир, 1974.

2.Нетесов С.В., Грачев С.A.

"Биоорганическая химия", 1981, т.7, )) 5, с. 790-791 (прототип) . (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ N spi, включающий разрушение биомассы в присутствии детергента, фракционирование полученного лизата центрифугированием, хроматографию .и диализ, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, разрушение клеток проводят смесью лизоцима и тритона Х100 (10:lj а клеточные компоненты фракционируют в двухфазной системе, содержащей

7,0-7,5%-ный полиэтиленгликоль моле|,кулярного веса 6000 и 2,0-2,1%-ный декстран Т 500 при рН 6,0-6,5 в присутствии 0,50-0,52 N NaC1.

1108106

Ти

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул, Проеткная, 4

Изобретение относится к получению ферментов нуклеинового обмена из микробных клеток, в частности к способу выделения эндонуклеазы М sp$ из биомассы Могахе11а species. Препарат фермента может быть применен в различных молекулярно-биологических исследованиях и при проведении генноинженерных работ.

Известен способ выделения ферментов в системе двух образующих фазы водорастворимых полимеров — полиэтиленгликольдекстран Cl l.

Недостатком способа является низкий выход ферментов.

Наиболее близким к изобретению 15 по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения рестриктазы М sp l ., включаю-щий суспендирование биомассы в калийфосфатном буфере рН 7,0, содержащем

0,2 M NaC1, 1 мМ ЭДТА, 7 мМ Ъ -меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия и

0,1% тритона Х100 последующее разрушение клеток ультразвуком,фракционирование клеточных компонентов с помощью ультрацентрифугирования, хроматографию на фосфоцеллюлозе и оксиапатите, диалиэ и концентрирование фермента С21.

Недостатком способа является невысокий выход рес три кта зы, о 6 условле н ный потерями при многостадийной очистке.

Цель изобретения — повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается 35 тем, что согласно способу получения эндонуклеазы рестрикции М sp, включающему разрушение биомассы в присутствии детергента, фракционирование полученного лизата центрифугировани- 40 ем, хроматографию и диализ, разрушение,клеток проводят смесью лизоцима и тритона Х100 (10:1), а клеточные компоненты фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7,0-7,5%-ный 45 полиэтиленгликоль мол.в. 6000 и 2,02,1%-ный декстран Т 500 при рН 6,06,5 в присутствии 0,50-0,52 M NaC1.

Способ осуществляют следующим образом. 50

Биомассу Moraxella species лизируют с помоцью лизоцима в присутствии тритона Х 100, затем фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликольдекстран (конечная концентрация в смеси полиэтиленгликоля

7%; декстрана 2%; NyC1 О, 5 М; рН 6, 3)

После тщательного перемешивания смеси и последующего центрифугирования отбирают верхнюю фазу, содержащую целевой продукт, наносят на ко- 60 лонку с фосфоцеллюлозой и проводят элюцию градиентом концентрации NaC1, ВНИИПИ Заказ 5838/18 фракции, содержащие эндонуклеазу

N sp g, собирают и концентрируют диализом против 55%-ного глицерина.

Пример . 5 г замороженной биомассы Moraxella species суспендируют в 10 мл 0,01 M Три -НС1-буфера рН 7,2, содержащих 0,01 М ь -меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия и 1 мМ

ЭДТА (буфер A) к суспензии добавляют 150 мкл 10%-ного тритона Х

100 и 15 мг лизоцима, лизируют 1 ч при 0-4 C и постоянном перемешивании.

Полученный лизат добавляют к смесостояцей из 3,7 мл 15%-ного водного раствора декстрана Т 500, 5,6 мл 35%-ного водного раствора полиэтиленгликоля 6000 и 3,5 мл 4 M

NaC1 (рН 6,0), тщательно перемешивают 15 мин, центрифугируют на холоду

20 мин при 4000 об/мин. Верхнюю фазу отбирают, разбавляют в 2 раза буфером A добавляют 10%-ный раствор тритона X.100 до конечной концентрации 0,1% и наносят на колонку с фосфоцеллюлозой р-11 (v=25 cM ), уравновешенную буфером А, содержацим 0,1%-ный тритон Х100 (буфер Б) .

Колонку промывают 50 мл буфера Б и фермент элюируют 0-1,0 N линейным градиентом концентрации NaC1 в буфере Б.-Общий объем градиента 150 мл.

Скорости нанесения на колонку, промывки и элюции 15 мл/ч. Фракции, содержацие целевой продукт, который вымывается в диапазоне концентраций

NaC1 0,45-0,55. М, объединяют (v

=18 мл), переносят в диализный мешок и концентрируют против 200 мл буфера .Б, содержащего 55%-ный глицерин.

Время диализа 5-8 ч, Полученный препарат эндонуклеазы M вр1 (4,0 мл, 75000 ед. акт. по гидролизу ДНК pBR

322) хранят при -20 С..

Тестирование препарата фермента на содержание неспецифических примесных ДНКаз и фосфатаз определяют инкубацией 5-(р меченого гетероолигодезоксирибонуклеотида с избытком тестируемого фермейта.

Инкубацию 10 пикомолей 5 -E Р.) меченого pdT-dC-dC-dA-dG-dA-dT-dCdT-dG-dG-dA проводят в присутствии

20,40 и 90 ед. акт. эндонуклеаэы

М эр, выделенной способом-прототипом и предлагаемым способом.

Сравнение полученных результатов показывает, что оба препарата фермента одинаково свободны от примесных нуклеаз и фосфатаз °

Полученный препарат эндонуклеазы рестрикции M sp пригоден для физического картирования геномов про- и эукариот и для проведения различных генно-инженерных экспериментов. раж 522 Подписное