Способ определения витамина @

Способ определения витамина @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА KY путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометотличающийрированием , с я тем, что, с целью повышения эффективности и точности способа, в качестве органического растворителя используют бензол, содерстсащий 1-2 об.% н-бутанола, и в качестg ве подвижной фазы используют гексан - хлороформ при объемном соотно- (Л шении компонентов 46-52:54-48.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECflYEi JlHH

З1Р) G 01 N 31/08

Ф

А"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТ0РСМОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1$ (I (21) 3505815/23-04 (22) 23. 08.82 (46) 23. 08. 84. Бюл. Ф 31 (72) А.Н. Стефанович, М.С . Жедек, И.А. Ионов и П.Ф. Сурай (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (53) 543.54.45(088.8) (56) 1. Davidek J., BIattna J.

Chromatigraphy of fat-soIubIe

vitamins onthin — Iayers ofaIumina."Chromatogr", 1962, v. 7, У 42, р. 204-210.

2. Федорова Г. А. Исследования в области анализа витамина К . Автореф. дисс. М., 1978 (прототип).

„.SU„„1109631 — A (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА К путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометрированием, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения эффективности и точности способа, в качестве органического растворителя используют бензол, содержащий

1-2 об.7. н-бутанола, и в качестве подвижной фазы используют гек- g сан — хлороформ при объемном соотношении компонентов 46-52:54-48.

1109631

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определе- 45 ния витамина К„путем экстракции его из анализируемой пробы органическим растворителем с последуюшим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля, в подвижной фазе, содержащей гексан, удалением целевого компонента с пластинки и фотометрированием, в качестве органического растворителя используют бензол, содержащий 1-2 об.% н-бутанола и использование в качестве подвижной фазы гексан — хлороформ при объемном соотношении компонентов 46-52:54-48.

Изобретение относится .к аналитической химии, в чаСтности к способам определения филлохинона (витамина К„), и может использоваться в различных аналитических лабораториях.

Известен способ определения витамина К1 в экстрактах растительных материалов на пластинке, покрытой слоем окиси алюминия с использованием в качестве подвижной фазы гексана и реактива обнаружения 1%-ного раствора 2,6-дихлорфенола или

70%-ной перхлоруксусной кислоты и индофенола (13.

Недотатком данного способа является недостаточно высокая эффек— тивность разделения витамина К„

1и сопутствующих компонентов (степень разделения не превышает 1,1).

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ определения витамина К„ путем экстрагирования его из образца гексаном, очисткой экстракта с последующим хроматографированием экстракта на пластинке со слоем силикагеля в подвижной фазе гексан — эфир, при соотношении компонентов 4:f удалением целевого компонента с пластинки и фатоцетрированием (2).

Недостатком известного способа является недостаточно высокая эффективность разделения целевого и сопутствующих компонентов (степень разделения не выше 1,277 и относительно малая точность определения содержания витамина К1.

Целью изобретения является повышение эффективности и точности способа.

1О

На чертеже представлен калибровочный график для определения количества витамина К, в экстракте из растительного материала.

Определение витамина К „проводят следующим образом.

Навеску травяной муки вносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 мп экстрагирующей смеси— бензол, содержащий 1-2 об.% н-бутанола, и ставят в темное место на

3 ч. Далее содержимое пробирки пропускают через колонку диаметром

8-10 мм, заполненную силикагелем и безводным сульфатом натрия, а пробирку ополаскивают пятью порциями по 5 мл экстрагирующей смеси, которые также пропускают через колонку.

Фильтрат выпаривают на роторном испарителе при 75-80 С и сухой остаток растворяют в 0,2 ип бензола.

Затем, с помощью микропипетки, переносят количественно полученный раствор на пластинку "Силуфол" и по обе стороны от образца нано- . сят раствор — свидетель витамина К„.

Хромато графирование (восходящее) проводят в камере для тонкоспойной хроматографии, насыщенной парами подвижной фазы гексан — хлороформ, взятых в соотношении 46-52:5448 об.%. После того, как фронт растворителя дойдет до верхнего края пластинки, ее вынимают, просушивают и быстро определяют положение витамина К„ по свидетелю под ультрафиолетовой лампой — обнаруживается в виде темной полосы.

Пятно силикагеля с адсорбированным витамином соскабливают с пластинки, переносят в пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мл

96%-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин для элюирования витамина. Затем элюат отфильтровывают через бумажный фильтр, смоченный этиловым спиртом, пробирку и фильтр ополаскивают 2 мл этанола. Далее фотометрируют элюат при длине волны 281 нм, переливают его в стеклянную центрифужную пробирку и облучают (сверху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой, в течение 7 ч. Затем повторно фотометрируют элюат при той же длине волны и по разнице показаний между пер1109631 где Х вЂ” содержание витамина К„н 1 г травяной муки, мкг, 1О

Š— оптическая плотность исследуемой пробы до облучения;

Š— оптическая плотность иссле2 дуемой пробы после облучения;

5 — объем элюата витамина К„ после хроматографиронания, МЛ;

1000000 — коэффициент пересчета г в мкг;

309 — прирост Е, Х;

100 — объем раствора, содержащего 1 r витамина К„, мл, А — навеска исследуемого материала, r .

Пример 1, Берут 500 мг. травяной муки, вносят навеску в пробирку с притертой пробкой, заливают 10 мл экстрагирующей смеси— бензол, содержащий 2 об.Х н-бутано- 30 ла (к 10 мл бензола добавляют

0,2 мл н-бутанола) и хорошо перемешивают. Пробирку ставят в темное место на 2 ч. Заполняют колонку диаметром 10 мм слоем силикагеля (2 см) и сверху него насыпают 1 см безводного сульфата натрия. Содержимое пробирки пропускают через колонку, а пробирку ополаскивают пятью порциями по 5 мп экстраги40 рующей смеси, которые также пропускают чере з колонку . Фильтра т выпаривают на роторном испарителе при 80 С и сухой остаток растворяют в 0,2 мп бензола.

Затем с помощью микропипетки переносят полученный раствор (0,2 мп) на пластинку "Силуфол", размером

15 «15 см, и по обе стороны образовавшейся полосы наносят свидетельраствор — 5 мкг филлохинона в

0,1 мл хлороформа.

Развитие хроматограммы проводят в камере (180-70 170 мм), насыщенной в течение 30 мин парами смеси

55 растворителей гексан — хлороформ, взятых в объемном соотношении

50:50. После того, как фронт подвижной фазы поднимется на высоту

35

45 вым и вторым измерениями определяют прирост экстинции.

Расчет содержания витамина К1 в исследуемом образце проводят по формула 5 (Eg — Е ) - 5 - 1000000

309 100 А

15 см, пластину вынимают из камеры, просушивают и быстро определяют положение витамина К„ по свидетелю под ультрафиолетовой лампой (проявляется н виде темной полосы).

Пятно силикагеля с адсорбированным на нем витамином К„ соскабливают с пластинки, переносят н пробирку с притертой пробкой, заливают 3 мп

96Х-ного этилового спирта и ставят в темное место на 30 мин. Затем отфильтровывают раствор через бумажный фильтр (красная полоса), смоченный этиловым спиртом, пробирку ополаскивают 2 мл этанола, который переносят на тот же фильтр. Далее фотометрируют фильтрат при длине волны

28 1 нм, переливают его в стеклянную центрифужную пробирку и облучают (снерху) лампой дневного света, расположенной на высоте 5 мм над пробиркой в течение 7 ч. Затем проводят повторное фотометрирование и по разнице показаний между первым и вторым измерениями определяют прирост экстинции и определяют количество витамина Кz, процент его извлечения и величины R сопутствующих компонентов. При этом количество витамина К,, определяемое по калибровочному графику (чертеж), заключено в диапазоне 5-30 мкг (2-6 мкг/мл).

В предлагаемом способе определено содержание витамина К на уров1 не 16,8 мкг/г (при 100Х извлечении) и величины R — для витамина

К,, равной 41, для р -каротина 87, 0L -токоферола 26, в то время как в известном способе величины R рав1 ны 62, 79 и 38 соответственно. Степень разделения витамина К„ и сопутствующих ему компонентов составляет в предлагаемом способе 1,62,12, а в известном — 1,27-1,6.

Пример 2. Осуществляют определение витамина К1, аналогично примеру 1, но н качестве подвижной фазы используют смесь гексанхлороформ, имеющую состав 46:54 об.Х

Результаты предоставлены в табл. 2.

Пример 3. Осуществляют определение витамина К„, аналогично примеру 1, но подвижная фаза гексан — хлороформ имеет состав

52-48 об.X. Результаты представлены в табл. 2.

Пример 4. Осуществляют определение витамина К„, аналогично

1109631

Та блица 1

Состав подвижной фазы, об. X

Компоненты

20 30 40 50 60 70

80 70 60 50 40 30

99 94 90 87 76 73

77 58 49 41 34 31

51 35 31 26 18 14

Гексан

Хлороформ

R каротина

R витамина К „

К токофенола

18

Таблица 2

Компоненты

Гексан

Хлороформ

42 44 46 48 50 52 54 56 58 60

58 56 54 52 50 48 46 44 42 40

Определено витамина

К. р Ж

97,9 97,6 99,7 99,8 100 101 99,0 98,2 97,1 96 рримеру 1, с подвижной фазой гекphd — хлороформ, имеющей различный объемный состав. Результаты предатавлены в табл. 2.

Пример 5. Осуществляют определение витамина К„, аналогично примеру 1, анализируя усредненный образец люцерновой муки, содержащий

19 мкг/г основного компонента. Параллельно проводятся анализы этого же образца по известному способу.

Результаты экспериментов представлены в табл. 3.

Данные табл. 1-3 свидетельствуют о том, что оптимальным соотношением гексана и хлороформа в подвижной фазе является интервал 45-52:

:54-48 об.X. В этих пределах достигается наиболее точное определение витамина К в исследуемом образ T це травяной муки и наилучшая эффективность разделения. В качестве экстрагентов витамина К„ из растительного материала используется бенэол в смеси с н-бутанолом. Сравнительный анализ выхода и определяемого количества витамина К, из од5 ного и того же образца при различном составе экстрагирующей смеси описывается следующим примером.

Пример 6. Определение витамина К„ проводят, аналогично примеру 1, но в бензол добавляют

1,5 об.X н-бутанола. Результаты представлены в табл. 4.

Таким образом, предлагаемый спо15 соб характеризуется повышенной эффективностью разделения витамина К, и сопутствующих ему компонентов (степени разделения увеличивается на 25-32X), кроме того повышается

20 точность определения количества витамина К„ в образце (величина стандартного отклонения уменьшается от

3,8 до 0,05).

Состав подвижной фазы, об.7

1109631

Таблица 3

Количество витамина Количество витамина

К„ в 1 г травяной К„ в 1 г травяной муки, мкг муки + 10 мкг стандарта витамина К„, мкг

R, витамина

К<

Возврат витамина К„, Х

Предлагаемый способ

98,2

19,11

98,1

98,2

41

98,3

98,0

98,2

18,99

Известный способ

93,2

68,33

63,5 t

94,9

91,8

73,61

65,29

95,9

67,71

90,4

60

90,5

71,98

Таблица 4

Компоне нты

Бензол

100 99 5 99 0 98 5 98 0 97 0 96 0 н-Бутанол

05 10 15

2,0

3,0 4,0

Количество витамина К„: мкг/г

16,80 16.,86 17,43 17,41 17,43 17,08 16,92

94,6 96,6 100,0 99,9 100,0 98,0 97, 1

Х извлечения

19,08

18,98

19,04

19,00

28,93

28,89

28, 79

28,87

28,80

28,81

77,65

73,00

82,79

74,88

76,75

81,03

Состав экстрагирующей смеси, об.X

1109631

Составитель В. Резников

Редактор Г. Волкова Техред Ж. Кастелевич Корректор N. Шароши

Заказ 6021/28 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушска наб. д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4