Способ диагностики острой стадии вирусного гепатита

Способ диагностики острой стадии вирусного гепатита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОЙ СТАДИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА путем исследования ферментативной активности сыворотки крови, отличающийс я тем, что, с целью повьшения точности способа, определяют активность фермента L -треонин- L, -серин-дегидротазы и при её наличии диагностируют острую стадию вирусного гепатита.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2960884/28-13 (22) 21.07.80 (46) 30.08.84. Бюл. Ф 32 (72) Т.Т.Березов, M.À.Акопов, З.С.Каган, К.M.Ëîáàí и С.П.Попова (71) Университет Дружбы народов им,Патриса Лумумбы (53) 612.07(088.8) (56) 1. йапот В.С. Биохимические аспекты опухолевого роста. М., 1975, с. 110-150 (прототип).,Я0.„111 443 А эсМ А 61 В 10/00; G- 01 и 33/48 (54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСТРОЙ

СТАДИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА путем исследования ферментативной активности сыворотки крови, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа, определяют активность фермента L -треонин- I„ -серии-дегидротазы и при ее наличии диагностируют острую стадию вирусного гепатита. разведение

1 11104

Изобретение относится к клиническОй биохимиид в частнОсти K энзимо» диагностике заболеваний печени.

Известен способ диагностики острой стадии вирусного гепатита путем исследования 43ерментативной активности сыворотки крови 1 13.

Однако известный способ характеризуется недостаточной точностью из-за относительной неспецифичности определяемых ферментов, так как они присутствуют и в других органах.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики острой стадии вирусного гепатита путем исследования ферментативной активности сыворотки крови, определяют активность фермента Ь вЂ .треонин20 — . -серии-дегидротазы и при ее наличии диагностируют острую стадию вирусного гепатита.

Способ осуществляют следующим образом.

В пробирку с гепарином, калий фосфатным буфером и пиридоксальфосфатом берут кровь из вены и центрифугируют. Супернатант 0 51 мл переносят в опытную инкубационную среду

L-треонин 0,3 M или L -серии, 1

1,5 мл О, 1 И трисбуфер, КС пирыдоксальфосфат О, 1 иИ.Реакцию останавливают подкислением среды Н,50+ (О, 1 мл). Затем инкубационные пробирки переносят в кипящую водяную баню.

После денатурации белка пробирки охлаждают и центрифугируют. В супернатант (2 — 1,5 мл) добавляют К-фосфатный буфер (3,5-3,0). Образовавшуюся в результате реакции сС-кетомаслян ю 40 кислоту определяют ферментативным методом с использованием лактатдегидрогенаэы и НАВН, .

Пример 1. Кровь из вены больного Н. помещают в пробирку с ге-4з парином, калий фосфатным буфером и пиридоксальфосфатом, центрифугируют.

Супернатант (надосадочную кровь) 1 мл переносят в опытную инкубационную среду, содержащую 0,3 M d-треонин 50 или с(-серии, трисбуфер О, 1 M (рН

9,0) !5 мМ, КС1 0,3 мИ, пиридоксальфосфат в объеме 2 мл. В контрольной пробе субстрат отсутствует. Инкубация проводится 1 ч в водяной бане приЯ

37 . Реакция останавливается подкислением среды О, 1 мл концентрированной .

Н,SO4. Затем инкубационные пробирки

43 2 .переносят в кипящую водяную баню.

После денатурации белка пробирки охлаждают и центрифугируют. Супернатант из опытной и контрольной проб переносят в стаканчики и добавляют 3 мл

К-фосфатного буфера 0,5 М рН=7,0.

Образовавшуюся в результате е(—

-треониндегидратазной реакции Ы,-кетомасляную кислоту определяют ферментативным методом, используя коммерческий препарат мьппечной лактодегидрогеназы. Для этого содержимое стаканчика нейтрализуют 10 н КОН. К всему объему нейтрализованной реакционной смеси добавляют 0,1 мл раствора

НАЗН,, имеющего концентрацию 8мг/мл.

Из смеси отбирают две аликвоты по

2,4 мл. К одной из них (опытной) добавляют 0 05 мл суспензии препарата лактатдегидрогеназы. Вторая аликвота после добавления 0,05 мл буфера служит в качестве контроля. Обе пробы инкубируют 15 мин при комнатной температуре. Убыль НАВН, определяют по уменьшению оптической плотности при

340 нм на спектрофотометре. Для расчета молярного количества израсходованного НАОН2 (соответствующего молярному количеству содержащейся в реакционной смеси oL-кетомасляной кислоты) используют молярный коэффициент экстенции НАЭН,, равный 6,22 »

«10 . При расчете удельной активности

L-треониндегидратазы учитывают указанные разведения, а также содержание в определенной смеси возможных субстратов лактатдегидрогенаэы, вероятно присутствующих в сыворотке крови, для чего проводили контрольный опыт каждой сыворотки без субстрата -треонина.

Относительная ошибка определения составляет 5 .

Удельную активность фермента выражают как количество единиц (Н моль/ч) на 1 MJI сыворотки.

Расчет активности, Удельная активность = время 6,22 1Оь объем сыворотки где аЭ вЂ” разность экстенции опытной и контрольной (без субстрата) пробирок, определяемая на спектрофотометре.

Пример . Расчет удельной активности исследуемого фермента прн острой стадии вирусного гепатита.

1110443

Составитель . Е.Житникова

Редактор Т.Иитейко Техред С.Иигунова Корректор И.Иуска

Заказ 6213/3 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 т

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, .ул. Проектная, 4

iD = 0,300 — ОУ100 = 0,200, 5.3 разведение = = 7 5

2 1 инкубация 1 ч, 6,22 -10 — коэффициент экстенции

Ь

2 У объем сыворотки 1 мл, удельная активность - †††- — =

0 200 7 5

1,6 22.10ь

240 ° 10 з моль/мп ч =

= 240 Н моль/мл.ч.

Результаты испытаний позволяют утверждать, что способ диагнос гики острой стадии вирусного гепатита с помощью предлагаемого фермента по сравнению с прототипом является более точным, поскольку появление фермента в сыворотке крови говорит о поражении только ткани печени, а не

10 еще какого-либо другого органа, свойственного другим ферментным тестам.