Способ получения антибиотика полимиксина

Способ получения антибиотика полимиксина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ЛЬ 111195

Класс 30h, 6

СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

С. М. Мамиофе, 3. T. Синицына и А. С. Хохлов

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

ПОЛ ИМИ КСИ НА

Заявлено 26 июня 1957 г. за,71 573516 в Комитет !1о:ела>! иаобретени!1 и открытий ири Совете Министров СССР

Изобретением является способ и >лучения антибиотика полимиксина из к льтуральной жидкости В. Роlуп;уха.

Г1рименение предлагаемого способа позволяет получать препарат высокой эффективности при лечении долго незаживающих ран, вызванных синегнойной палочкой.

Отличительная особенность способа зак:почастся в том, что культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой, бактериальные клетки и выпавшие соли отфильтровывают, а прозрачныйфильтрат подщелачивают едким натром, после чего антибиотик адсорбируют

In раствора на катиопите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсорбцией на катионите СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите

ЭДЭ-10, упаривают и сушат для выделения твердой солянокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавляют к полученному раствору сульфат триэти, lа 1!1111II !l 11етя но, Ic, въ!п!1 вшпп сульфат полцмиксица отфильтровывают, промывают метанолом и сушат в вакууме.

Гl р и м е р 1. 90 I культуральной жидкости c clKTIIBIIocTblo 2100 ед1х1.1 определяют чашечным методом с тест-организмом Евс11ег!с1!1а Со11, обрабатывают при псрсмешиваниц насыщенным раствором цьавелевой кислоты (2,6 I) до достижения полноты осаждения кальция и рН раствора = 3,0, Выпавший осадок окса;1ятя K2;Ib ция со взвесью бактерия lb!Iblx клеток отделяют фильтрованием, я прозрачньш нят11вный раствор нейтрализуют 10,io -ным раствором едкого натра (1,75 л) до рН 6,5 — 7,0.

Прозрачный нятивньш раствор (96 л с активностью 1750 ед!л..!) пропускают через колонку с дцяметро» 2,5 с.и и высотою 40 с.и, наполненную 7 г катцо!штя КБ4-П2 в натриевой форме, со скоростью

1 л i!ac!:. Ионцт с адсорбировянным на нем полимиксином (92,3 10в ед) промывают 2 л дистиллированной воды до достижения прозрачной

К 111195 промывной воды, а затем 70 лл метанола, после чего проводят вытеснение антибиотика 0,35 и раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 10 ял/час/:. ионита.

Полученные 300 л л раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10 в ОН-форме и получают 340 мл раствора активностью 16,3 10 едlмг.

Всего получают 55,4 10 ед, что составляет 60о о по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите. С учетом элюатов более низкой концентрации зыход достигает

65 /о.

300 мл указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку с диаметром 3 см и высотою

60 см, наполненную 270 г катионита

СБС-1 в Н-форме со скоростью

2 ял/час/г кятпонита. Зятем кислый раствор нейтрализуют с помощью анионита ЭДЭ-10 до рН раствора 6,5.

Получают 373 мл раствора с активностью 118.10 ед/,ял и 50 мл с активностью 27 10- eo, ë.г, Прямой выход антибиотика на стадиях îáработки ионитами СБС-1 и ЭДЭ-10

90о/о. Общий выход на этих стадиях 94 8о/о.

Сухой препарат полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина выделяют так.

1. 170 лл раствора антибиотика после очистки ионитами СБС-1 и

ЭДЭ-10 с активностью 118 10 гд/лл упаривают в вакууме при 35 — 40 до /4 первоначального объема; выпавший при упаривании неактивный осадок отделяют фильтрованием, после чего прозрачный концентрат упаривают в вакууме досуха.

Получают 2,34 г солянокислого полимиксина с активностью

7100 ед/.яг. Всего 16,6 10о ед. Выход на стадии упаривания и получения сухого препарата 83,о. Выход солянокислого полимиксина от антибиотика, copoHpOBBHHOI катионитом из культуральной жидкости, около 45о/о.

2. К 200 л л раствора антибиотика с активностью 118 10" ед лл дооазляют 2 н раствор триэтиламинсульфатя в метаноле (13,5 мл) до полноты осаждения сульфата полимиксина.

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием, промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Получают

1,56 г препарата с активностью

10. 10З ед/люг. Всего 15,6-10о сд.

Препарат растворяют в 30 ял дистиллированной воды, отделяют фильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола осаждают сульфат полимиксиня.

Последний отделяют фильтрованием и высушивают в вакууме прп температуре не выше 45 .

Получают сульфата полимиксина

1,52 г с активностью 10 10 ед/лг.

Всего 15,2 106 ед. Выход ня стадии выделения сульфата полимиксина

64,4 о/о. Общий выход полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости, 360о/о.

Пример 2. 75 л культуральной жидкости с активностью 2300 ед/мл определяют чашечным методом с тест-организмом Escherichia Coli, обрабатывают при перемешивании насыщенным раствором щавелевой кислоты (2,5 л) до достижения полноты осаждения кальция и рН раствора 3,0. Выпавший осадок аксалата кальция со взвесью бактериальных клеток отделяют фильтрованием, а прозрачный нативный раствор нейтрализуют 10 /о-HbIM раствором едкого натра (1,75 л) до рН 6,5 — 7,0.

75 л прозрачного нативного раствора с активностью 1900 ед/мл пропускают через колонку с диаметром 2,5 см и высотою 40 см, наполненную 5 г катионита КБ4-П2 в натриевой форме со скоростью

1 л/час. В фильтрате — 65 10 ед; сорбировяно ионитом 77 106 ед.

М 111195

Ионит с адсорбированным на нем полимиксином промывают 1,8 л дистиллированной воды до достижения прозрачной промывной воды и затем 50 г метанола, после чего проводят вытеснение антибиотика

0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле со скоростью 50 мл/чае/г ионита.

Полученные 320 мл раствора солянокислого полимиксина в метаноле нейтрализуют анионитом ЭДЭ-10, после чего получают 350 мл раствора с активностью 15,2 104 ед/мл и общим содержанием антибиотика

53,2 10 ед, что составляет 67,2% по отношению к полимиксину, сорбированному на ионите.

С учетом элюатов более низкой концечтрации выход достигает 71%.

Емкость катионита по отношению к п ол и м икси ну 15,4 10 ед/г.

320 мл (общая активность

48,6 10 ед) указанного выше раствора солянокислого полимиксина в метаноле профильтровывают через колонку высотою 60 см и диаметром 3 см, наполненную 260 г катионита СБС-1 в Н-форме со скоростью 2 мл/час/г катионита.

Получают 365 мл раствора; активность 12,7 104 ед/мл; общая активность 46,3.10 ед. Прямой выход на стадии обработки СБС-1

95%. Общий выход с учетом слабых промывок 98,0%.

Выделение сухого препарата полимиксина из метанольного раствора солянокислого полимиксина производится следующим образом.

1. 200 мл кислого раствора антибиотика (общая активность

25,4 10 ед), очищенного с помощью ионита СБС-1, нейтрализуют до рН б,б фильтрацией через анионит ЭДЭ-10. Объем раствор а

225 мл. Активность 11 ° 104 ед/мл.

Общая активность 24,7 10 ед.

220 мл нейтрализованного раствора солянокислого полимиксина концентрируют до /4 первоначального объема в вакууме при температуре

35 — 40 .

Выпавший при упаривании осадок отделяют фильтрованием, после чего концентрат высушивают в вакууме досуха.

Получают 3,06 г солянокислого полимиксина. Активность препарата

6800 ед/мг. Всего 20,810 ед, Выход на стадии получения сухого препарата 86% . Выход солянокислого полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культур альной жидкости, 51.0 /ю.

2. 150 мл кислого раствора антибиотика, полученного после очистки катионитом СБС-1 с активностью

12,7 104 ед/мл нейтрализуют 8 мл триэтиламина до рН 6,5. K нейтрализованному раствору добавляют

12,5 мл 2 н раствора триэтиламинсульфата в метаноле до полноты осаждения сульфата полимиксина.

Выпавшую сернокислую соль антибиотика отделяют фильтрованием, промывают метанолом до отсутствия в промывном метаноле следов хлоргидрата и сульфата триэтиламина и высушивают в вакууме при комнатной температуре.

Получают 1,35 г препарата с активностью 9 10 ед/мг. Всего

12,1 ° 10 ед.

Препарат растворяют в 25 мл дистиллированной воды, отделяют фильтрованием небольшой неактивный осадок и из прозрачного раствора добавлением 100 мл метанола выделяют сульфат полимиксина

Последний отделяют фильтрованием, высушивают в вакууме при температуре не выше 45 .

Получают сульфата 1,3 г активностью 9 10 ед/мг. Всего 11,8.10 ед

Выход на стадии выделения сульфата полимиксина 61,4%. Общий выход сульфата полимиксина от антибиотика, сорбированного катионитом из культуральной жидкости, 38%.

Предмет изобретения

Способ получения антибиотика полимиксина из культуральной жидкости В. Ро1утуха, о тл и ч а юшийся тем, что, с целью пол чения препарата высокой эффективности, культуральную жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. бактериальные клетки и выпавшие соли отфильтровывают. а прозрачный фильтрат подшелачпвают ед№ 111195

Отв. редактор И. В. Макаров

Стандартгпз. Подп. к печ. 5/IV 1958 г. Объем 0,25 п. л. Тираж 300. Цена 50 коп.

Типография Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Неглинная, 23. Зак. 1362. ким натром, после чего антибиотик адсорбируют из раствора на катионите КБ-4-П2 и элюируют 0,35 н раствором соляной кислоты в метаноле, из которого неорганические примеси удаляют адсороцией на катионите СБС-1, а содержащий антибиотик раствор или нейтрализуют на анионите ЭДЭ-10, упаривают и сушат для выделения твердой солянокислой соли полимиксина, или нейтрализуют триэтиламином, добавляют к полученному раствору сульфат триэтиламина. в метаноле, выпавший сульфат полимиксина отфильтровывают, промывают метанолом и сушат в вакуу ме.