Штамм @ @ @ @ -3 @ -продуцент эндонуклеазы рестрикции @ @

Штамм @ @ @ @ -3 @ -продуцент эндонуклеазы рестрикции @ @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Штамм Serratia marcescens BKM R-3D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции Sma 1.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

О

РЕСПУБЛИК

0% 01) 3Ш С 12 N 15/00; С 12 R 1 43 1 .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОЧНРЫТИЙ (21) 3576395/28-13 (22) 11.04.83 (46) 23. 09. 84. Бюл. У 35 (72) P.Х.Беляева (НРБ), Л.И.Ли, P.Ë.Ãoðîâèö, А.С.Солонин, В.И.Таняшин, Е.Г.Крюкова, И.E.Лузина, В.А.Ежов и А.А.Баев (71) Институт биохимии и Физиологии микроорганизмов АН СССР (53) 577. 15(088.8) (56) 1. Roberts R.J. Restriction and

Modification Enrymes and Their Recognition Sites — "Gene", 1978, vol 4, р. 183-193. (54) ШТАММ SERRATIA MARCESCENS BKM

R-3D — ПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ SMA 1. (57) Штамм Serratia marcescens ВКМ

R-3D (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФМ АН СССР) — продуцент эндонуклеазы рестрикции Sma 1.

1114700

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано дл,i получения эндонуклеазы рестрикции

Sma 1 (R.Sma 1).

R.Sma 1 — эндонуклеаза рестрикции, разрезающая двунитевую молекулу ДНК в участках, имеющих нуклеотидную последовательность К.Sma 1

5 ... ССС GGG ...3

3 ... GGG ССС ...5

В результате образуются фрагменты с тупыми" концами. R.Sma 1 используется в работе в области молекулярной биологии, генетики, генной инженерии.

Известен единственный штамм — продуцент R.Sma 1 — Serratia marcescens

S (13.

Известный штамм — продуцент рестриктазы Sma. 1 Serratia marcescens S@ устойчив ко многим антибиотикам (Su

Km, Тс, Cm, Pn, Рг, Ох, Sm), но чув 25 ствительный к ампициллину.

Нами был взят вариант продуцента

Serratia marcescens SBR, который устойчив к ампициллину. Подобной множественной устойчивостью к антибио° 30 тикам обладают многие штаммы Serratia

marcescens, не являющиеся продуцента— ми рестриктазы Sma 1. Для подготовки штамма-продуцента R.Sma 1 к ферментации в условиях производства целесо— образно ввести специфический генетический маркер.

Цель изобретения — обесечение возможности отбора и контроля при культивировании штамма, что особенно важно в условиях промышленного получения фермента R.Sma 1.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-продуцента R.Sma 1 используют штамм Serratia

marcescens SBRTp. Он депонирован во 45

Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКМ

R-ЗД.

Штамм обладает селективным маркером, обеспечивающим устойчивость к 0 триметонриму (Тр), который он стабильно сохраняет.

Описание штамма-продуцента R.Sma 1

Serratia marcescens ВКМ R-ЗД.

Морф 1логические признаки. Грамот- SS рицательная подвижная палочка с перитрихальными жгутиками. Принадлежит к семейству Entегоbacteriaceae. Образование недиффундирующего пигмента продигиозина варьирует в зависимости от условий культивирования и среды.

Физиолого-биохимические признаки.

В качестве источника углерода могут быть использованы цитрат и ацетат.

Из углеводов сбраживает целлобиозу, инозитол, глицерол Ces выделения газа и мальтозу, сахарозу, глюкозу с выделением небольшого количества газа. Не сбраживает арабинозу.

Реакция с метилротом — отрицательная, а реакция Фогеса-Проскауера положительная.

Содержание Г+Ц в ДНК 58-58,4 мол.7.

Образует эндонуклеазу рестрикции

ДНК Бша 1 и неспецифические ДНКазы.

В зависимости от условий культивирования уровень активности фермента

Sma варьирует от 200 до 800 ед на

1 r биомассы.

Культуральные признаки. Хорошо растет на твердых и жидких мясопептонных и минеральных средах. Оптимальная температура роста 30 С.

Генетические признаки. Содержит рекомбинантную плазмидную ДНК мол. веса 5,4 тысяч п.о., обеспечивающую устойчивость штамма к триметоприму (1,5-500 мкг/мл).

Чувствителен к налидиксовой кислоте, канамицину, гентамицину и неомицину.

Штамм получен трансформацией штамма S. marcescens SBR плазмидной

ДНК pBR 322 frd. Было показано, что штамм S.marcescens SBR чувствителен к присутствию в минимальной питательной среде 1-2 мкг/мл триптометоприма, химического вещества антибактериального и противоопухолевого действия.

В основе механизма устойчивости к триметоприму лежит его взаимодействие с ферментом дигидрофолатредуктазой, катализирующей восстановление дигидрофолиевой кислоты в тетрагидрофолиевую. Последняя участвует в биосинтезе пуринов и пиримидинов. Как аналог фолиевой кислоты, триметоприм является конкурентным ингибитором фермента.

Этим объясняется чувствительность бактериальных штаммов к триметоприму (Escherichia coli, Straphylococcus

aureus, Proteus vu1garis).

При исследовании некоторых мутантов Escherichia coli, устойчивых к

Тр, показано два типа устойчивости.

В одном случае устойчивость объясня3 11147 ется повышенным синтезом дигидрофолатредуктаэы мутантом по сравнению с диким штаммом, в другом случае — несколько измененными свойствами дигидрофолатредуктазы у мутанта. 5

В результате клонирования структурного гена, кодирующего дигидрофолатредуктазу фага Т4 в плаэмидный вектор pBR 322, получена рекомбинантная плазмидная ДНК pBR 322 frd. В плазмиду pBR 322 интегрирован Hind III фрагмент фага Т4 размером 1, 1 тыс. пар оснований, содержащий структурный ген дигидрофолатредуктазы. Введение плазмидной ДНК pBR 322 frd в бактери-15 альные клетки придает им устойчивость к триметоприму. Цель достигнута тем, что вводится новый специфический маркер в микроорганизм с множественной устойчивостью к традиционным лекарст- р0 венным веществам. Это позволяет при выращивании S. marcescens SBRTp использовать селективные среды, содержащие Тр. Генетический маркер в составе плазмидной ДНК стабилен — при 25 выращивании в неселективных условиях лишь около 67 клеток S marcescens, SBRTp за 50 генераций теряют устойчивость к триметоприму. Это дает возможность следить за штаммом при его хранении, пересевах и больших ферментациях в промышленном масштабе.

Пример. Получение штамма

Serratia marcescens ВКМ R-ЗД.

Трансформация Serratia marcescens

SBR. Кальциевые клетки Serratia marcescens SBR трансформируют ДНК рекомбинантной плазмиды pBR 322 frd, несущей ген дигидрофолат-редуктазы фага Т4 и обеспечивающей устойчивость40 реципиентных клеток к триметоприму.

Трансформированные клетки Serratia

marcescens высевают на поверхности агариэованной среды, содержащей, г/л: NH

NaC1 5; MgCI> 7Н О 0,1; СаС1 2Н О

0,015; глюкоза 2, бакто-агар 15, с добав кой триметоприма 10 мк г /мл.

Доказательство наличия плазмидной

ДНК, обуславливающей устойчивость к 50 триметоприму клеток Serratia marcescens. Методом скрининга выделяют плазмидную ДНК из всех полученных клонов Serratia marcescens BKM R-ЗД, растущих на агаризованной среде с 55

10 мкг/мп триметоприма. Выделенной

ДНК одного из этих клонов трансформируют клетки Escherichia coli 802 с

О0 последующим высевом на селективную среду, содержащую Тр.

Рестрикционный анализ полученной плаэмидной ДНК с помощью рестриктаэы

Hind III указывает на наличие в ней фрагмента размером 1,1 тыс. пар оснований, обеспечивающего Тр-устойчивость бактериальных клеток.

Проверка стабильности плазмидной

ДНК в клетках Serratia marcescens ВКМ

R-ЗД. После 50 генераций в неселективных условиях (без добавки триметоприма) не более 67 клеток штамма-лродуцента Serratia marcescens ВКМ R-ЗД теряют плазмидную ДНК.

Из этих данных следует, что клетки

Serratia marcescens BKM R-ЗД стабильно сохраняют плаэмидную ДНК, обеспечивающую их устойчивость к триметоприму.

Культивирование Serratia marcescens BKM R-3Д.

Получение посевного материала.Хра-. нящуюся исходную культуру Serratia шагсеясепя ВКМ R-ЗД рассевают на чашки Петри с агариэованной средой M-9, содержащей 10 мкг/мл триметоприма, и выращивают при 30 С в течение 12 ч.

Полученную на чашках культуру засевают петлей в пробирки с 10 мл среды

М 9, содержащей 1 мкг/мл триметоприма, и выращивают при 30 С на качалке в течение 8 ч.

Культуру из пробирок переносят в количестве 1Х в колбы с 0 5 л среды

M-9 с 1 мкг/мл Тр и выращивают при

30 С на качалке 12 ч (о.п. 0,9, кювета 0,3 см, ФЭК).

Посевной материал в колбах используется для засева ферментера.

Культивирование Serratia marcesсепя BKM R-ЗД в ферментере. Количество посевного материала — 3 от объема загруженной среды.

Культивирование в ферментере ведут при 30 С, подаче воздуха 1,2 объема на 1 объем среды в минуту (90 л/мин), перемешивании 500 об/мин и до оптической плотности суспенэии клеток

1,25 ед (кювета 0,3 см, ФЭК).

Продолжительность культивирования

5 ч на среде следующего состава,г/л: бакто-пептон 5, дрожжевой экстракт.

5, К НРО 1, глюкоза 2.

Выделение R. Sma. 1.

Фермент выделяют стандартным методом. Выход фермента иэ клеток

Serratia marcescens BKM R-ЗД 400 ед на 1 г биомассы.

1114700

Составитель В.Кузьмичев

Редактор С.Пекарь Техред И,Гергель Корректор И.Иуска

Заказ 6735/18 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Рассмотренный пример подчеркивает основное преимущество предлагаемого штамма-продуцента R.Sma перед исходным штаммом SBR (базовый объект).Оно заключается в том, что штамм содержит 5 маркерный ген дигидрофолатредуктазы фага Т4, обуславливающий устойчивость клеток S. marcescens к триметоприму.

Таким образом, при использовании штамма в качестве продуцента R.Sma в промышленном производстве значительно упрощается его отбор и селекция.