Способ диагностики хронического гепатита

Способ диагностики хронического гепатита

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА путем исследования ткани печени, отличающийс я тем, что, с целью ранней диагностики , ткань печени разделяют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферами с рН 7,,2 в течение 18-22 мин и с рН 7,,02 в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и при увеличении его в сравнении с нормой диагностируют хронический гепатит.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

Э Ф

РЕСПУБЛИК (191 (111

3(5D А 61 В 10 00 G 01 1 1 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA

Ы". ", .:„ 11"

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1; (21) 3462907/28-13 (22) 14.05.82 (46) 30.09.84. Бюл. В 36 (72) M.Â.KóäðÿâöåBà, Е.Э.Завадская, Б.Н.Кудрявцев, С.А.Смирнова и А.Д.Скорина (71) Институт цитологии и Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт (53) 615.07(088.8) (56) 1. Блюгер A.Ô. Основы гепатологии. Рига, "Медицина", 1975, с. 124-126, (54)(57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА путем исследования ткани печени, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью ранней диагностики, ткань печени разделяют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферами с рН 7,8+0,2 в течение 18-22 мин и с рН 7,2+0,02 в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и при увеличении его в сравнении с нормой диагностируют хронический гепатит.

1115722

Изобретение относится к медицине, преимущественно диагностике заболеваний и непосредственно к диагностике хронического гепатита.

Известен способ диагностики гепатита путем исследования .ткани печени, заключающийся но взятии материала ткани печени с помощью пункционной биопсии, приготовлении и гистологической обработке препарата и установ- 1О ленин заболевания по состоянию ткани печени L13.

Этот способ позволяет установить форму заболевания в целом и лишь грубо оценить его степень только при сильно выраженном либо далеко зашедшем процессе. Проводить раннюю и точную диагностику заболевания, а также оценить степень его тяжести с достаточной чувствительностью 20 этот способ также не позволяет. Это обусловлено тем, что первоначально поражение охватывает отдельные клетки паренхимы печени и лишь позднее ткань и орган в целом, что выража- 2g ется прежде всего в тонких изменениях структуры клеток и содержании в них различных компонентов. При слабо выраженных персистирующих формах хронического гепатита признаки заболевания также наиболее выражены лишь на клеточном уровне, что невозможно установить стандартной качественной гистологической методикой.

Целью изобретения является повышение точности диагностики.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики хронического гепатита путем исследования ткани печени, ткань печени раз4О деляют на изолированные клетки последовательной обработкой ее фосфатными буферами с рН 7,8+0,02 в течение 18-22 мин и с рН 7,2+ 0,02 в течение 13-15 мин, далее в изолированных клетках определяют содержание гликогена и при увеличении его в сравнении с нормой диагностируют хронический гепатит.

Способ осуществляют следующим образом.

Ткань биопсийного материала последовательно обрабатывают двумя фосфатными буферами: первым с рН

7,8+0,02 в течение 18-22 мин и вторым с рН 7,2+0,02 в течение 1315 мин. Затем из кусочков, взятых из второго буфера, приготавливают мазки живых изолированных клеток, которые фиксируют абсолютным метанолом. На полученных препаратахмазках определяют относительное содержание гликогена в клетках с помощью известного цитофлуориметрического метода„ включающего флуоресцентную PA-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена; при этом флуоресцентную PA-реакцию с последующей цитофлуориметрией гликогена ставят на трех препаратах диагносцируемого материала и одном эталонном с известным содержанием гликогена. После этого устанавливают абсолютное содержание гликогена в клетках диагносцируемого материала путем сравнения относительных результатов, полученных на диагносцируемых и эталонном препаратах„

При увеличении содержания гликогена в клетках диагносцируемого материала по сравнению с нормой диагнос— тируют гепатит.

При этом мазки живых изолированных клеток приготавливают путем перемещения капли взвеси;их на предметные стекла и разнесения каждой капли по предметному стеклу с помощью кварцевого стекла со шливованным краем.

В качестве эталонного препарата используют неокрашенный препаратмаэок фиксированных изолированных клеток печени с известным содержанием гликогена в граммах, который получен от лабораторного животного.

После одновременной цитофлуориметрической обработки эталонного препарата с тремя диагносцируемыми в последних определяют содержание гликогена по формуле

Х вЂ” -10

Ь„,(КПК) где — содержание гликогена в клетках печени человека, г;

Э (КЛЧ) — интенсивность флуоресценции клеток печени человека (усл.ед.);

2с {KIIK) — интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клетками печени человека (усл. ед.); содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного г.

1115722

Операцию по изоляции клеток из ткани печени путем последовательной обработки материала фосфатными буферами проводят только на живых клетках, что позволяет длительно сохранить их неповрежденными и получить точные панные цитофлуориметрического анализа.

Сравнение диагносцируемого материала с эталонным препаратом, в 10 котором известно содержание гликогена в граммах, необходимо для получения результатов в абсолютных единицах.

Пример. Донор, 28 лет, по- 15 ступил в больницу по поводу носительства Н+ (антиген вирусного гепатита) для обследования. При обсле— довании функциональные биохимические пробы оказались в пределах нор- 20 мы.

Была проведена пункционная биопсия. Получено около 10 мг материала ткани печени. Половина этого материала была отправлена в клини- 25 ческую лабораторию для приготовления и немедленной обработки препаратов гистологическими методами.

Другая половина была немедленно

30 подвергнута количественному анализу на содержание гликогена в клетках с применением цитофлуориметрического метода, и полученные результаты абсолютного содержания гликогена были сопоставлены со стандартными показателями степени поражения лев чеки согласно разработанному способу.

Для этого кусочек ткани печени помещали в стеклянный бюкс объемом 10 мл с первым фосфатным буфером рН 7,8, 40 где выдерживали в течение 18 мин.

После этого глазными ножницами кусочки разрезали на несколько частей и помещали во второй фосфатный буфер с рН 7,2 в другом бюксе того же объема. По истечении 13 мин из кусочков приготавливали мазки живых изолированных клеток. Пля этого малым глазным пинцетом извлекали каждый обработанный кусочек и выделяли из него живые изолированные клетки в каплю второго фосфатного буфера на поверхности предметного стекла путем осторожного потряхивания кусочка с помощью пинцета. Затем получечную взвесь живых изолированных клеток разносили по поверхности предметного стекла с помощью тонкого кварцевого стекла с ровным шлифованным краем. Для этого осторожно прикладывали к капле взвеси шлифованный край кварцевого стекла и быстрым, но плавным движением проводили им по всему стеклу. Фиксация мазка производилась немедленно пу— тем нанесения капли абсолютного мета " иола пипеткой на предметное стекло с мазком живых изолированных кле— ток печени. Фиксированный таким образом мазок высушивали на воздухе.

Общая продолжительность указанных операций составила 40 мин. Было получено 10 препаратов-мазков изолированных клеток печени. На трех препаратах полученного диагносцируемого материала провели флуоресцентную

PA — реакцию. Продолжительность реакции при стандартных режимах 4 ч.

Вместе с тремя препаратами диагносцируемого материала флуоресцентную

РА-реакцию проводили еще и на эталонном одном препарате-мазке изолированных клеток печенилабораторного животного с известным содержанием гли— когена в граммах на 1 клетку печени.

Указанный эталонный препарат был взят невыборочно из серии

100 таких неокрашенных препаратов, которые предварительно были приготовлены следующим образом. Первоначально приготавливали препараты микрокапель 1Е-ного раствора гликогена, микрокапли покрывали акриловым клеем, картировали и определяли в них количество гликогена в граммах с помощью интерференционного микроско— па марки МБИН-4. Затем приготавливали собственно эталонные препаратымазки, для чего производили перфузию печени нормальной крысы смесью

t/15 М фосфатного буфера с рН 8 и

5Х сахаровы (1:1) в течение 10 мин.

После этого из перфузированной пече— ни крысы вырезали небольшие кусочки, которые помещали в другой 1/15 М фосфатный буфер с рН 7,3 и там выдерживали в течение 8 мин. Из обработанных таким образом кусочков печени крысы приготавливали 100 препаратов1 мазков изолированных клеток по указанной методике.

Содержание гликогена на эталонном препарате, а именно в клетках печени крысы, устанавливали путем одновременного цитофлуориметрического определения гликогена на.трех препара1115722 тах микрокапель 17-ного раствора гликогена и на трех из 100 эталонных пр препаратах-мазках из расчета по формуле

У = — -- — ° 10 г, 5 Х -л

3g где 3 — - среднее содержание гликогена на 1 клетку печени данного лабораторного животного (KP61Cbl) g содержание гликогена в микро каплях гликогена, определенное интерферометрически, г; интенсивность флуоресценции микрокапель гликогена с изве стным его содержанием окраск флуоресцентной РА-реакцией;

3 — средняя интенсивность флуоре1 ценции клеток печени данного лабораторного животного, обработанньгс флуоресцентной РА S -реакцией и измеренных с помощью цитофлуориметрии одновременно с препаратом микрокапель гликогена.

Расчетами по этой формуле установлено, что среднее содержание гликогена на одну клетку печени крысы на эталонном препарате составило

243 10 + +г, После установления содержания гликогена на эталонных препаратах из оставшихся 97 неокрашенных эталонных был выборочно взят один, который и использовали для сравнения тремя препаратами диагносцируемого материала.

Цитофлуориметрию гликогена на трех препаратах диагносцируемого материала и одновременно на одном эталонном после проведения на них флуоресцентной PA-реакции производили на опытном образце микрофлуориметра. Цитофлуориметрию препаратов производили в течение 3 ч, в результате была оценена интенсивность флуоресценции 700 изолированных клеток печени больного и для сравнения 300 изолированных клеток печени на эталонном препарате. Результаты измерений обрабатывали статис.тически на 3ВМ. При обработке данных учитывались показатели эталона микрокапель гликогена и данные указанного биологического препарата-эталона, что в целом позволило контролировать условия всех операций цитофлуориметрического анализа. Каждый из

700 измеренньгх показателей интенсивности флуоресценции клеток больного сопоставляли со средним показателем

5 каждог о эталона-препарата. Среднее абсолютное содержание гликогена на 1 клетку печени больного было определено по формуле

3+ (КПЧ)

Х ° а ° 10 г

Л (КПК) где X — содержание гликогена в клетках печени человека, г;

15 .1(КПЧ) — интенсивность флуоресценции клеток печени человека, усл.ед.;

З,г,(КПК) — интенсивность флуоресценции клеток печени лабораторного животного, обработанных параллельно с клетками печени человека, усл.ед.

a — содержание гликогена в эталонном препарате клеток печени лабораторного животного,г.

Этими расчетами установлено, что у больного содержание гликогена в клетках печени соответствует (203,1+

6,9) ° 10 г. Диагностика и определелг ние степени тяжести хронического re30 патита у больного проведены путем сопротивления этих показателей с установленными ранее стандартными показателями степени тяжести пораже— ния печени на массовом статистически достоверном клиническом материале, Эти показатели представлены в таблице.

В результате было установлено, что повреждение клеток печени соот4р ветствует средней степени по вышеприведенным показателям, что отражает среднюю тяжесть хронического гепатита, Результаты исследования другого

45 кусочка из того же биопсийного материала были получены через 7 сут после биопсии. Диагноз по этой методике (прототипу1 после сопоставления с результатами клинико-биохимическо50 го анализа был следующий: у больного достоверных признаков вирусного гепа.гита не обнаружено, имеются признаки вирусного поражения части печеночных клеток. указано, что исследование необходимо повторить.

Через некоторое время больной вновь поступил в больницу с симптомами гепатита — ноющие боли в области печени, слабость, отсутствие аппеСреднее содержание гликогена в изолированных клетках печени человека, 10 г

Степень поражения

Норма слабая

267019+12.12 (213,3-357,6) 190,9+2,06 (172,9-209,3) 144,69+2,52 (116, 7-162, 6) 85,56+3,8 (37,7-119,4) П р и м е ч а н и е. В скобках минимальные и максимальные значения.

Составитепь Е.Житникова

Редактор M.Äûëûí ТехредЛ.Мартяшова КорректорМ.Шарощи

Заказ 6803/3 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 11 тита и т.п. Биохимические показатели и протеинограмма близкие к норме (исключая легкое. повышение билирубина). Окончательный диагноз — хронический персистирующий вирусный гепатит.

Таким образом, применение предлагаемогь способа в случае даже однократной биопсии позволило диагносцировать хронический гепатит у больного и определить среднюю степень тяжести его заболевания. При использовании комплексного клинического метода диагностики, включающего в себя и способ-прототип, сходный диагноз был установлен на 17 дней позже.

15722 8

Использование предлагаемогб способа диагностики хронического гепа тита позволяет по сравнению с извест.ными повысить точность диагностики за счет оценки степени тяжести заболевания по объективным количественным показателям состояния специализированной функции печени на клеточном уровне; установить более раннюю

1О диагностику за счет повышения чувствительности способа, а также за счет ускорения его технологии по сравнению с прототипом; повысить надежность диагностики благодаря

15 возможности использования 3ВМ в клинической практике при обработке количественных диагяостических показателей заболевания.