Способ получения иммуносупрессивного фактора

Способ получения иммуносупрессивного фактора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСУ- , ПРЕССИВНОГО ФАКТОРА путем экстракции томогената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости центрифугиро ванием, фильтрованием : и вьщелением целевого продукта, о тл и ч a ю щ и и с я тем, что, с целью расширения спектра иммуносупрессивного действия целевого продукта, в качестве исходной ткани используют лимфатические узлы морской свинки, центрифугирование проводят непосредственно после экстракции,, фильтрат диализируют через полупроницаемую мембрану против дистш1лирс |ванной воды, далее диализат концентрирует, фракционируют его на колонке с сефадексом -15 и отбирают фракции с молеку-( лярной массой дальтон. ,

ае (19

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

«««

РЕСПУБЛИК зсю A 61 К 35/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .. ««авто«с««о««««с««ир««тввСтв««

I OCY4APCTBEHHbIA HOMHTET CCCP

П0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

; (21) 3311223/28-13 (22) 22.05.81 (46) 15. 10.84. Бюл. В 38 (72) В.Т. Антоненко и З.И. Лиссова (71) Киевский государственньй инсти-, тут усовершенствования врачей (53) 576.8.097(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

9 578968, кль А 61 К 35/30, 1977.

2. Borel J. Е. etal, The effects

of fractions (chalones) obtained from

lymphoid organs on the immune response

in iivo — Agents and Actions, 1978, 8, 5, р.- 523-531.(ïðoòîòèï).

:(54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИИУНОСУПРЕССИВНОГО ФАКТОРА путем экстракдии гомогената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта, о т- л и ч а ю шийся тем, что, с целью расширения спектра иммуносупрессивного действия целевого продукта, в качестве исходной ткани используют лимфатические узлы морской свинки, центрифугирование проводят непосредственно после экстракции, фильтрат диализируют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной водш, далее днализат концентрируйт, фракционируют его на колонке с сефадексомf 15 и отбирают фракции с молеку- Я лярвой массой 100-500 дальтон.

1 1118

Йзобретение относится к медицине

I и касается способа получения иммуносупрессивного фактора.

Известен способ получения иммуносупрессивного фактора с использова,нием органов животных .(1j .

Известен также способ получения иммуносупресснвного фактора путем экстракции гомогената тимуса -и селезенки телят, с последующим отделе- . 1б нием надосадочной жидкости центрифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта (2) .

Однако известные способы не обеспечивают получение. целевого продук- 15 та с широким спектром иммуносупрессивного действия.

Цель изобретения — расширение спек. тра иммуносупрессивного действия целевого продукта. 20

Эта цель достигается тем, что со.гласно способу получения иммуносупрессивного фактора путем экстракции гомогената исходной ткани с последующим отделением надосадочной жидкости цент-25 рифугированием, фильтрованием и вьделением целевого продукта, в качестве

/ исходной ткани используют лимфатичесГ ие узлы морской свинки, центрифуги1 рование проводят непосредственно по- 3п сле экстракции, фильтрат диализуют через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды, далее диализат концентрируют, фракционируют. его на колонке с сефадексом f -15 и отбирают фракции с молекулярной мас- сой 100-500 дальтон.

Пример. 5 г ткани лимфатических узлов морских свинок гомогениэируют с помощью микроизмельчителя тка-4О ней PT-2 (5000 об/мин, 5 мин), экстрагируют 24 ч при +4 C (на 1 часть ткани — 10 частей 1,14 N раствора NaC1 рН 7,2) и затем центрифугируют со ско" ростью 15000 об/мин в течение 30 мин 45 о при + 4 С. Надосадочную жидкость филь-. труют через фильтровальную бумагу и диализируют через полупроницаемую мембрану (почечный целлофан) против 10 объемов дистиллированной воды (рН ?, 2) 5О в течение 24 ч. Диализат концентрируют выветриванием в целлофановых куль-. ках под. вентилятором при + 4 С1о объема 10 мл. Концентрировайный диализат экстракта лимфатических узлов 55 морских свинок подвергают фракционированию на хроматографической колонке 2х100 см, заполненной сефадек367 2 сом С-15 и стабилизированной 0,14 М раствором NaC1 рН 7,2. Характерный профиль кривой элюции регистрируют на спектрофотометре СФ-16 при длине волны 280 нм. Собирают фракцию, выходящую из колонки в объеме элюиции

500-600 мл, идентифицируют по спектру поглощения в УФ-области (максимальное поглощение в области 200-210, 230-240 и 270-280 нм) и концентрируют выветриванием в целлофановых кульках в 10 раз.

С целью определения молекулярной массы выделенного вещества на ту же колонку наносят вещества с известной молекулярной массой, в данном случае АТФ (молекулярная масса (551,15) и аминокислоту валин (молекулярная масса 117, 15) .

Данное вещество выходит из колонки в объеме элюции позднее АТФ, но раньше валина, т.е. его молекулярная масса менее 500, но более 100 дальтон.

Супрессивную дозу фактора вводят мьппам линии СВА подкожно, одновременно с внутрибрюшинным введением взвеси эритроциров барана в 0 ° 14 М

9 растворе NaC1 в дозе 2х10 клеток.

У животных определяют содержание

Т- и В-лимфоцитов в тимусе, селезенке и лимфатических узлах, количество антителообразующих клеток в селезенке, блисттрансформирующую способность

Т-лимфоцитов с ФГА и титры агглютининов и гемолизинов в сыворотке крови. Кроме того, определяются сроки жизни кожного аллотрансплантата под влиянием вьдененного фактора.

В табл. 1 показано влияние введения иммуносупрессивного фактора лимфатических узлов морских свинок на показатели клеточного и гумморального иммунитета у мышей линии

СВА.

Полученный препарат проявляет выраженный иммуносупрессивный эффект на некоторые показатели клеточного (снижение содержания Т- и В-лимфоцитов в лимфоидных органах, угнетение бласттрансформирующей способности Т-лимфоцитов) и гуморального иммунного ответа (снижение титров аглютининов и гемолизинов в сыворотке крови) у мышей, т.е. его иммуносупрессивный эффект более выражен по сравнению с прототипом и распространяется на Т- и В-системы иммунитета.

18367 4

Эффективность использования иммуносупрессивного фактора, полученного по предлагаемому- способу из ющмфоузлов морской свинки в сравнении с прототипом доказывается примерами .табл. 2.

Т а бли ц а 1

Группа животных

Показатели

Опытная (ЭБ-ИСФ)

П *75

Контрольная (ЭБ) п91

МФЩ

Т-лимфоциты, Х тимус.

91,2 4 0,8

56,8+ 3,9 селезенка

57,4 + 3,5 лимфоузлы

15,71 1,1

8,9Й 1,0 с0,05 а0,001

22,9> 2 ° 8

18,0 1,6

Лнтителообраз ующие клетки (иа 10 кл.) 286,21 32,1

290 « 27,3. >0,05

1 ° 8 1,1

40,001

16,6+ 1,3

8 1+ Оф31

9,3+ 0,24 рО 05

Титры аглютининов с0,001

1 3.38э50+ Оэ20

1:132,51+ 8 ° 72

1 45,25+ 0,82

1:99,53> 8 32 с 0t05

Титры гемолизинов

3 11

В то Кр. время вьщеленный фактор не оказывает влияния на содержание антителообразующих.клеток в селезенке и не изменяет продолзительнЬсть мизни кокного аллотрансплантата у мы- шей (табл. 1).

В-лимфоциты, 3 селезенка лимфоузлы

Реакция . бласстранс. формации с ФГА

Продолжительность визни коаного аллотрансплантата, сут.

3098k 3,1

39,2-1 3,1

40>8> 5э3

40,01 сО 05 с.0,05

1118367

Т а б л и ц а 2

Показатели

Прототип,; полученный иэ тимуса селезенки

Не влияет

Содержание антител в сыворотке крови:

Угнетение на 90Х

Угнетение на 15Х аглютинины гемолизины

Угнетение на 100Х

Угнетение на 90Х

Снижено íà 60Х

30Х селезенка

ЗОХ лимфоузлы

Содержание В-лимфоцитов в

Снижено на 40Х селезенке

60Х лимфоуэлах

Продолжительность Нет статистически достоверных различий по сравнению лизни кожного алло- с контролем трансплантанта

Реакция "Трансплантат против хозяина" То же

Составитфть В. Дроздов

Редактор Л. Авраменко Техред А.Кикемезей Корректор А. Тяско

Заказ 7312/4 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Содержание антитело- Стимуляция образующих клеток 100«530Х в селезенке в зависимости от дозы

Реакция басттрансформации с неспецифическим митовеном Угнетение на 76Х

Содержание Т-лимфоцитов в лифмондных органах.

Стимуляция

40-470Х в зависимости от" дозы

Иммуносупрессивный фактор (ИСФ)