Способ получения алкалоидов спорыньи

Способ получения алкалоидов спорыньи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОВДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде. содержащей источники углерода и азота , генеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания /3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26°С и рН 5,25 ,8. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью дополгнительного повьшения выхода целе вых . продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мл валика I или 0,12 г/100 мл валИна и изолейО ) цина при соотношении последних 5:1.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК зж С 12 Р 1 Об А 61 К 35/66

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ЪРФ" гас(1(7

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (21) 3245499/28-13 (22) 06.02.81 (31) 282/80 (32) 08.02.80 (33) ВНР (46) 15.10.84. Бюл. N - 38 (72) Геза Вак, Янош Кишш, Жужа Лендьель, Лайош Надь, Ева Удварди Надь, Карой Залаи и Эржебет Жока (BHP) (71) Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр PT (ВНР) (53)д678.044.29 (088.8) (56) 1. Патент Бельгии N 824987, кл . С 12 D, 1977 (прототип) . (54) (57) t. СПОСОБ ПОЛУЧЕБИ АЛКАЛОИДОВ СПОРЫНЬИ путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, „„SU„„iИВВЯ A содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью направленного биосинтеза алкалоидов типа эргокорнина и повышения содержания j3-эргокриптина, в качестве продуцента используют штамм

Claviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26 С и рН 5,25,8.

2. Способ поп. 1, отличаюшийся тем, что, с целью допол.— нительного повышения выхода целе— вых продуктов, ферментацию ведут в присутствии 0,2 г/100 мп валина или 0,12 г/100 мп валина и изолейци на при с оот ношении п осл едних 5: 1 .

1119609

Изобретение относится к медицине в частности к способам получения алкалоидов спорыньи.

Известен способ получения алкалоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта 1 3.

Однако известный способ не обеспечивает получения повышенного содержания р -эргокриптина в алкалоид ной смеси.

Белью изобретения является направ- 15 ленный биосинтез алкалоидов типа эргокорнина и повышение содержания

f3 -эргокриптина.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения алка- 2О лоидов спорыньи путем ферментации продуцента Claviceps purpurea в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм

С1aviceps purpurea MNG 00186, а ферментацию ведут при 20-26 С и рН

5, 2-5, 8.

ЗО

Ферментацию ведут в присутствии

О, 2 г/100 мл валина или G, 12 г/100 мл валина и изолейцина при соотношении последных 5:1 °

Для осуществления способа используют новый штамм Claviceps purpurea

LING 00186, который получен путем многократного повторения операции выделения и обогащения. Штамм хранится в национальной коллекции куль.

4О тур микроорганизмов MNG под номером

00186 и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого — биохимическими свойствами

Культурально-морфологические

45 признаки.

На применяемой для отбора агаровой среде, содержащей крахмал и

Фриптофан, через 10 дней наблюдаются четко разграниченные колонии со складчатой поверхностью и оранжево5О розовой окраской диаметром 6-8 мм.

Через 20 дней диаметр колоний состав ляет 20-25 мм, колонии имеют в середине возвышение и радиальную складчатость, цвет — розово-лиловый. Ниж- 55 няя сторона колоний темно коричневая, питательная среда вокруг них окрашивается в лиловый цвет .

На солодовом агаре через 10 дней штамм образует светло-бежевые когонии диаметром 1-2 мм и правильной полусферической формы. Через 20 дней колонии имеют диаметр 2-4 мм, рост слабый, окраска изменяется до коричневой.

На Sf-агаре колонии штамма через

10 дней четко разграничены, в направлении к середине изборождены складками, в середине имеют остроконечное возвышение,,циаметр колоний

8-12 мм. Вершина имеет высоту 3-5 м ..

Окраска колоний бежевая до светлокоричневой. Через 20 дней поверхность колоний твердее и по направлению к краям изборождена разветвляющимися складками, вершина становится кратерообразной, Колонии имеют св=-1— ло-коричневую окраску с оттенком какао, диаметр различный (25-40 мм), высота 6-8 мм, Колонии с трудом отделяются от поверхности агара, не образуют спор.

Микроскопическая характеристика амма в жидкой к ул ьт ур е .

После 40 ч культивирования в питательной спеце СК имеются колонии из немногих клеток %ли большей частью отдельные клетки. Величина клеток 48 х 8-20р.. клетки п„ линдрические, округленнь1е или неправильной формы.

Деление на конце клеток и путем бокового ветвления. Ряды клеток короткие, состоят из нескольких клеток.

Под фазовоконтрастным микроскопом клетки оказываются сильно гранулированными, более старые клетки содержат вакуоли. Спорообразования нет.

В St-питательной среде после 40 ч культивирования наблюдается идентичная картина, при этом на питательной среде имеется более частое образование колоний или рядов клеток. Отдельные клетки более крупные, более старые клетки не имеют вакуолей. физиолого-биохимические свойства.

Разрушает с помощью фермента p— фруктофуранозидазь. сахарозу с получением промежуточных олигосахаридов, хорошо использует лимонную кислоту, образует пигмент антрахинновогG характера, состоящий в первую очередь из оксиантрахинонов.

При культ.;гвировании на питательной среде, содержащей сахар и аммониевую соль органической кислоты, штамм продуцирует алкалоиды, 25-307. образующейся смеси алкалоидов пред—

f 11960

7,0

4,0

0,3

0,3

До рН 59 7-598

Д 8 0

09 2З

0,25

1,0

1,0 ставляет собой pg -эргокриптин, основное количество (55-60X) — эргокорнин, оставшаяся часть — -эргокриптин.

Кроме характерных пептидньгх алкалоидов. штамм образует только эргометрин.

Пример 1 . Выращенную на

St-агар-питательной среде культуру

Ciaviceps purpurea NNG-00186 инокулируют на 100 мл питательной среды

GK находящейся в колбе Эрленмейера 1О (500 мл) и инкубируют при 24 С на встряхивающем аппарате (300 встряхиваний в 1 мин) в течение 4 дней. Полученную культуру по 10 мл повторно инокулируют в восьми других колбах, содержащих по 100 мл St rèòaòåëúíoé среды. Эти культуры ферментируют при о

24 С на встряхивающем аппарате в течение 7 дней. В 4 колбы не прибавляют исходное вещество, к содержимому других 4 колб в начале ферментации прибавляют по 2 r валина в качестве исходного вещества. На 7 день ферментацию прекращают. Культуральные жидкости без исходного вещества объединяют, определяют содержание алкалоидов в них. Содержание эргскорнина состав ;,res 80 g/ìë9 с -эргокриптина — 15 /мл и р -эргокриптина

30 л/мл .

ЗО

Приготовленные вместе с исходным веществом культуральные жидкости также объединяют и определяют содержание алкалоидов. Эти жидкости содержат.

)(/мл эргокорнин 250, с -эргокриптин

25 и /э -эргокриптин 30.

Применяемые питательные среды.

Питательная среда:

Трипказин, г

Лимонная кислота, r

Кислый фбрсфорнокис— лый калий (первичный), г

Сульфат магния, г

Гидроокись аммония . Вода, мл

В колбы наливают до 84 или 840 мл питательной среды и в стерильных условиях смешивают соответственно с 16 и

i60 мл 507-ной лимонной кислоты. 50

St-питательная среда:

Сахароза, r 100, 0

Янтарная кислота,г 10,0

Кислый фосфорнокислый калий (п ер вич ный), r 55

Сульфат магния,г

Нитрат аммония, г

ХлopHe rü 1 калии, 9 4

Гидроокись аммония До рН 5, 2-5,3

Вода, мл До 1000

Питательную среду стерилиэуют порциями по 100 мл в колбах Эрленмейера или в количестве 100 л в полупроизвод" ственном ферменторе. St àãàð-питательная среда (Blake) отличается от жидкой питательной среды St тем9 что к ней прибавляют 25 г/л порошка агара.

После добавки ar apa питательную среду кипятят, порциями по 150 мл наливают в бутылочки и стерилизуют.

ff p и м e p 2. Типичные выращенные на St-агар-питательной среде двадцатидневного возраста колонии

Claviceps purpurea ИИС 00186 отделяют от поверхности агара, гомогенизируют в 20 мл стерильного физиологичес кого раствора поваренной соли и 10мл суспензии прибавляют к f00 мл предварительно простерилизованной находящейся в колбе Зрленмейера (500 мл)

St-питательной среды. Культуру культивируют в течение б дней при 24 С на встряхивающем аппарате и затем

pовторно инокулируют на 100 мл находящейся в колбе Эрленмейера (500 мл) питательной среды ТС-54. После 3 дней ферментации на встряхивающем аппарате 10 мл культуры повторно инокулируют на f00 мл находящейся в колбе

Зрленмейера (500 мл) простерилизовачной St-питательной среды. Эту культуру при укзанных условиях культивируют на встряхивающем аппарате в течение 7 дней, После этого она содержит следующие количества алкалои- : у/woI эргокорнин 150, криптин 40,и р-эргокриптин 90. !

Пример 3. Двадцатипятидневную культуру Claviceps purpurea NNG

00186 íà St-агар — питательной среде удаляют, соскребая, с поверхности агара и гомогенизируют в 100 мл физиологического раствора поваренной соли.

Полученной суспензией инокулируют.

1 л питательной среды GK предварительно простерилиэованной в колбе

Эрленмейера объемом 3 л . Культуру встряхивают при 24 С в течение 44

Затем культуру помещают в. фермеитор объемом 15 л, в котором находится 1 О л пи тат ел ь ной ср еды ТС -54 . Фер— ментируют при 24 С подаче 0,25л/л мин воздуха и 240 об/мин. Через 3 дня культуру переносят в кислотостойкий лабораторный ферментор (150 л).

f 1119609 Ь

f котором находится 100 л St-питательной ) ОО r валина и 20 г изолейцисреды. Эту культуру культивируют на. при 22 С 150 об/мин и 0,35 л/л мин После ферментации в течение шести подводимого воздуха в течение 6 дней. дней культуральная жидкость содержит

На 2 —, 3- и 5-й день к культу- 5 у/мп: зргокорнин 320, c(, -эргокриптин ральной жидкости прибавляют по 60 и Р -эргокриптин 160.

Составитель Е.Ярных

Редактор Л.Веселовская Техред Л.Коцюбняк Корректор С.Черни

Заказ 7480/46 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по деламизобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП"Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4