Способ получения 5-или-3-фосфодиэфиров моно-или олигонуклеотидов

Патент 1121266

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ зФОСФОДИЭФИРОВ МОНО- Ш1И ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ путем конденсации нуклеотидного компонента со спиртом в растворителе в присутствии производного карбодиимида, отличаю щи йс я тем, что, с целью упрощения прог: цесса и увеличения выхода целевого продукта, процесс осуществляют в водной среде, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли МОНО- или олигонуклеотидов и в качестве производного карбодиимида 1-э тил-3

COf03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК, SU„„1121266

З(51 С 07 Н 19/00; С 07 Н 21/00

„(.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ :

Й aBTOPCICMV 0ВМЮетипьстВУ /

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Д Ю. ПВа а (21) 3570488/23-04 (22) .30.03 .83 (4 6) 30. 10. 84. Бюл. У 40 (72) М.Б. Готтих, М.Г. Ивановская и З.А. Шабарова (53) 547.963.32.07(088.8) (56) 1. Гринева Н.И., Сайкович Е.Г.

Метоксисульфонилэтиловые эфиры олигонуклеотидов вЂ” новые реагенты для метилирования нуклеиновых кислот в комплементарных комплексах. вЂ” "Биоорганическая химия", Т. 5, 1979, Ф 4, с. 563-567.

2. Shumyantseva U.×., Sokolova N.J.

Shalarova Z. А. Modification of end

phosphate groups in mono and oligonucleotides. Nucl. Aciels Res., v. 3, N 4, р. 903-916, 1965.

3. Pongs О., Lanka E. СЬешьсаПу Reactive 0ligonucleotides. In: Methods in Enzymology (Jacoly W.Â., Wi1chek М. ed., New-York-London)

f977, ч. 46, р. 669-676.

4. Smith М., Khorana Н.С. Preparation of Nucleotides and Derivatives, In; Nethods in Enzymology (S.P., Kaplan N.0 . ed., New-York-London), 1963, v.6, р. 645-669 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5- ИЛИ 3ФОСФОДИЭФИРОВ МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ путем конденсации нуклеотидного компонента со спиртом в растворителе в присутствии производного карбодиимида, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения прот; цесса и увеличения выхода целевого продукта, процесс осуществляют в вод-. ной среде, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли моно- или олигонуклеотидов и в качестве производного карбодиимида 1-этил-3(3-диметиламинопропил)карбодиимид.

11212

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения фосфодиэфиров моно- или олигонуклеотидов, которые используются в биоорганической химии и молекулярной биологии для аффинной модификации белков, нуклеиновых кислот и мембран, в энзимологни для выделения и изучения субстратной специфичности ферментов нуклеинового обмена, в медицине для направ- 10 ленного воздействия на генетический аппарат клетки.

Известно» несколько способов получения фосфодиэфиров моно- и олигонуклеотидов, однако имеющиеся спосо- 15 бы сложны, ниэкоэффективны и непригодны для работы с микроколичествами дорогостоящего олигонуклеотидного ма" териала.

Известен, например, способ получе- 20 ния 5 -фосфодиэфиров рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидов с помощью дифенилхлорфосфата, согласно которому получение фосфодиэфиров проводят в две стадии: сначала из три- 1,-алкиламмониевой соли олигонуклеотида при действии дифенилхлорфосфата в безводном диметилформампде получают активированный пирофосфат олигонуклеотида, затем при действии спирта в безводном диметилформамиде в течение 17-24 ч по. лучают необходимый фосфордиэфир. Выход фосфордиэфиров олигонуклеотидов составляет 18-25Х Г13.

Низкая эффективность метода объяс-35 няется наличием побочных процессоввЂ” расщепления олигонуклеотидов и изомеризации в случае рибо- олигонуклеотидов. Кроме того, перевод олигонуклеотидов сначала в три- п -алкиламмо- 40 ниевые, а затем обратно в водорастворимые соли осложняет осуществление процесса и снижает выход целевых соединений.

Известен способ получения фосфор- 45 диэфиров через смешанные ангидриды с мезитиленкарбоновой кислотой, который также включает две стадии: получение смешанного ангидрида при действии хлорангидрида мезитиленкарбоно-50 вой кислоты на моно- или олигонукле- отид в безводном пиридине, получение целевого фосфордиэфира в пиридине при взаимодействиии смешанного ангидрида с безводным спиртом 1.2 ).

Недостатком этого способа является необходимость перевода моно- и олигонуклеотидов в форму, раствори66 2 мую в органических растворителях, поскольку обе стадии процесса проводятся в безводной среде, а также большая длительность процесса от

2-4 сут. Существенным недостатком способа является также резкое уменьшение выходов фосфодиэфиров при увеличении длины длигодезоксирйбонуклеотида. Так, если в случае фосфордиэфиров мононуклеотидов выходы составляют в среднем 80Х (в некоторых случаях 50-60X) то уже в случае динуклеотидов выходы соответствующих фосфордиэфиров падают до 60 . Для получения фосфодиэфиров олигонуклеотидов рибо-ряда способ непригоден, так как при действии хлорангидрида меэитиленкарбоновой кислоты на олигорибонуклеотид происходит расщепление и изомеризация межнуклеотидных связей.

Известен способ получения фосфордиэфиров олигонуклеотидов с применением фермента вЂ” полинуклеотидфосфорилазы, который состоит в том, что фосфордиэфир получают на мононуклеотиде и затем проводят наращивание олигонуклеотида ферментативным путем.

Уже на первой стадии процесса при получении и -нитрофенилового эфира мононуклеотида в безводном пиридине при действии дициклогексилкарбодиимида в течение 8 сут, выход составляет

20-50Х. После проведения ферментативных стадий процесса выход целевого фосфордиэфира олигонуклеотида не превышает 10Х (3 3.

Недостатками данного способа являются низкая эффективность, необходимость использования большого числа дорогостоящих ферментов и невозможность получения таким путем фосфодиэфиров олигонуклеотидов дезокси-ряда.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности является способ получения 3 вЂ” или 5 -фосфодиэфиров моно- или олигонуклеотидов, в частности 4-нитрофениладенозин 5 фосфата, 4-нитрофениладенилил-3 -5 вЂ” гуанозин-5 -фосфата, 4-нитрофениладенилил-3 -5 -гуанилил-3 -5-тимиI I дин-5 -фосфата, заключающийся в конденсации нуклеотидного компонента (пиридиниевой или три- ь -алкиламмонийной соли моно- или олигонуклеотида) с безводным спиртом в безводном органическом растворителе (пиридин или диметилформамид) в присутствии производного карбодиимида (дицикло" з 1121 гексилкарбодиимида). Выходы целевых продуктов 50-707.. Время процесса

2-8 сут. При получении метиловых эфиров мононуклеотидов и коротких 2-4звенных олигодезоксирибонуклеотидов в безводном метаноле выходы фосфодиэфиров составляют 80-90Х за 2 сут 1).

Недостатками указанного способа . являются резкое уменьшение выхода фосфодиэфиров олигонуклеотидов при

10 увеличении длины олигонуклеотидной цепи в результате параллельно проте- кающих процессов модификации нуклеодитного материала, которые приводят к необратимым потерям и деградации олигонукл отидов, необходимость !

5 проведения процесса в безводном органическом растворителе, что связано с трудоемкой и низкоэффективной операцией перевода нуклеотидного материала сначала в три- и -алкиламмони20 евую форму, а по окончании процесс-обратно в водорастворимую форму.

Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения 5вЂ” ( или 3 вЂ” фосфодиэфиров моно- или оли-гонуклеотидов, конденсацию нуклеотидного компонента со спиртом осуществляют в водной среде в присутствии производного карбодиимида, используя в качестве нуклеотидного компонента водорастворимые соли моно- и олигонуклеотидов и в качестве производного35 карбодиимида 1-этил-3-(3-диметилами-, нопропил)карбодиимид.

Выход целевых продуктов составляет 80-100Х. Время процесса 1-20 ч в зависимости от природы спирта. 40

Преимущества предлагаемого способа состоят в использовании в качестве конденсирующего агента водорастворимого карбодиимида, что позволяет проводить процесс в воде и работать с 45 водорастворимыми солями олигонуклеотидов. В результате этого отпадает необходимость дважды переводить олигонуклеотид из одной формы в другую, при этом исключаются неизбежные ранее50 трудноконтролируемые потери дорогостоящего нуклеотидного материала и впервые появляется возможность работать с микроколичествами олигонуклеотидов, PHK и ДНК. 55

Кроме того, способ позволяет высокоэффективно получать фосфоэфиры моно- и олигонуклеотидов любой длины

266 4 и состава избирательного по концевым фосфатным группам, так как в водной среде не протекает никаких побочных процессов, связанных с модификацией гетероциклическчх оснований, межнуклеотидных фосфатных групп и изомеризацией и расщеплением фосфодиэфирных связей.

Предлагаемый способ позволяет получать фосфодиэфиры моно- или олигонуклеотидов со спиртами различной природы вЂ” фенолами, алифатическими, аралифатическими и многоатомными спиртами, т.е. является более общим по сравнению с известным.

Преимуществом предлагаемого способа является также простота проведения процесса и простота выделения полученных соединений, поскольку исключаются такие операции, как экстракция, высаживание, неизбежно приводящие к некоторым потерям дорогостоящего нуклеотидного материала.

Пример 1. KNa-соли dpT (10 ОЕ26о, 1 мкмоль, коммерческий препарат в виде порошка) добавляют

100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль)

1-этил-3(3-диметиламино-пропил) карбодиимида. Через 0,5 ч при 20 С полученную смесь фракционируют с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 М триэтиламмонийном буфере с рН 7,5-8,0 (фиг. 1). Выход метилового эфира дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Соответствующие фосфодиэфиры йрТ с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике.

Пример 2. Водный раствор

d(pTCTAG) в виде МН+ -соли (1 ОЕ

24 о

0,02 мкмоль) упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль)

1-этил-3(3-диметиламинопропил) карбодиимида. Выдерживают смесь в течение

1,5 ч при 20 С и затем иетиловый эфир пентануклеотида выделяют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 957 (фиг. 2).

Фосфодиэфиры пентануклеотида с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике.

Пример 3. Водный раствор (рА) в виде Na-соли (2 OF.2üî

0,02 мк-моль) упаривают до масла и добавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-3(3-диметиламино1121266

Выход фосфодиэфира, Ж

Спир

0,5

dpT

100

Метиловый

1,0

Бенэиловый

18,0

Иэопропиловый

Этиленгликоль

1,0

100

1,5

h -Нитрофенол

Метиловый

d(pT-С-Т-А-G) 0,0002

1,5

Этиловый

24,0

Изопропиловый и --Нитрофенол

Метиловый

3,0

d(TGGCCAAGCTp) 0,0001

2,5

3,0

Этиленгликоль ь -Нитрофенол

4,0

97 (рА)р

2,0

0,0002

Метиловый

2,0

Этиловый

2,5

Этиленгликоль пропил)карбодиимида. Выдерживают смесь 2 ч при 20 С и полученный метиловый эфир гептадениловой кислоты выделяют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 97Х (фиг.3).

Фосфодиэфиры (рА)т с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной метбдике.

Пример 4. Водный раствор

d(TGGCCAAGCTp) в виде NH -соли

0 (1 ОЕ, 0,01 мкмоль) упаривают до

Моно- или олигонуклеотид масла и дооавляют 100 мкл 4 М водного раствора метилового спирта и 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-З(3-, диметиламинопропил) карбодиимида. Выдерживают смесь 2,5 ч при 20 С и полученный метиловый эфир декануклеотида вьщеляют колоночной анионообменной хроматографией с выходом 90Х (фиг. 4).

Фосфодиэфиры декануклеотйда с другими спиртами (см. таблицу) получены по аналогичной методике.

Концентрация Время нуклеотида, М процесса ч

1121266

0г

15 20

Охаем элюеищц чл .08 ои

Оъем элюслим, мл

1121266

%paso 1

< 035

Ъ 1

fS ГР

РХа м элювмта, мл

Составитель Ю. Голова

Редактор А. Гулько Техред C,Ìèãóíîâà Корректор С. Черни

Заказ 7884/17 Тираж 380 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ЛПН "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4