Способ получения конъюгированных антигенов

Способ получения конъюгированных антигенов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ на основе морфина при рН 8-9, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, осуществляют взаимодействие морфина, антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1:

COIO3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1123704 A зсмк А 61 К 3900

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ;:::.-, /

Н А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КО НЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ на основе морфина при рН 8 — 9, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, осуществляют взаимодействие морфина, антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1:(2 — 10):I. (21) 3605523/28-13 (22) 08.04.83 (46) 15.11.84. Бюл. № 42 (72) Л. А. Пирузян, И. Е. Ковалев, О. IO. Полевая и Л. А. Башарова (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 576.8.097 (088.8) (56) 1. Gros S. J., Grandt J. D., Wong S.R., Schister R., Ommunochemistry, 1974, р. 11, 453 †4.

2. Ковалев И. Е., Полевая О. Б., Башарова Л. А., Шайров В. В. Ковалентное связывание морфина с белком для получения антител, нейтрализующих токсическое действие морфина. Химико-фармацевтический журнал. 1977, № 5, 12 — 15.

1123704

Изобретение относится к иммунохимии, а именно к способу получения конъюгированных антигенов морфин-антигенный носитель, которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к морфину и родственным ему соединениям, нейтрализации их токсического и фармакологического эффекта, а также для определения опиатов в жидкостях и тканях организма.

Известны способы получения конъюгированных антигенов морфин-антигенный носитель, согласно которым обычно получают реакционноспособное производное морфина, которое затем ковалентно связывают с антигенным белковым носителем, например сывороточными белками.

Известен способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина путем сочетания морфина с диазониевой солью п-а минофенилацетамида, выделения полученного азопроизводного морфина и гид- !! ролиза его с получением морфиназофениламина, который затем с помогцью производного карбодиимида ковалентно связывают с бычьим сывороточным альбумином. Полученный конъюгированный антиген выделяют известными способами (1).

Недостаткам такого способа являются его многостадийность и трудоемкость.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения конъюгированных антигенов на основе морфина, предусмат- 30 риваюгций взаимодействие морфина с монодиазотировапным бензидином с выделением полученного производного, его диазотированием и связыванием с антигенным белковым носителем при рН 7 — 9. Обычно в качестве антигенного белкового носителя З используют бычий сывороточный альбумин и соотношение производного морфина и белкового носителя составляет 1:(2 — 10) (2).

Недостатками этого способа являются длительность и трудоемкость процесса полу- 4р чения конъюгированных антигенов на основе морфина. Реакционноспособное производное морфина получают в несколько стадий, при этом исходная молекула морфина значительно изменяется за счет введения дополнительных химических группировок, что в дальнейшем сказывается на специфичности антител. Необходима также стадия выделения и очистки п ромежуточ ных производных, применение в ходе синтеза растворителей, концентрированных солей и ше- 5g лочей, а также токсичных веществ (бензидин) .

Цель изобретения — упрощение процесса получения конъюгированных антигенов.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов на основе морфина при рН 8 — 9 осуществляют взаимодействие морфина антигенного белкового носителя и феррицианида калия при соотношении 1:(2 — 10):1.

В предлагаемом способе конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель получают в одну стадию. B реакцию связывания с антигенным носителем вступает реакционноспособное производное морфина-соответствуюший феноксирадикал морфина, который образуется при взаимодействии морфина с феррицианидом калия.

Способ осуществляется следующим образом.

Водный раствор хлоргидрата инкубируют с равным весовым количеством феррицианида калия в присутствии раствора бычьего сывороточного альбумина в течение

1-2 ч при рН 8 — 9 и 0-25 С при соотношении морфин: антигенный носитель: феррицианид калия 1: (2--! О):1.

Полученный конъюгированный антиген морфин-антигенный носитель отделяют от низко молекулярной фракции гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Содержание морфина в синтезированном конъюгированном антигене определяют по разнице введенного в реакцию и непрореагировавшего морфина известным способом. В зависимости от соотношения исходных реагентов получают конъюгированные анти гены, в которых с одной молекулой антигенного носителя (бычьего или человеческого сывороточного альбумина) ковалентно связаны от

1! до 20 молекул морфина. Структура полученных конъюгированных антигенов подтверждена данными УФ-спектров, в которых по сравнению со спектром исходного белка увеличивается интенсивность поглощения и смещение максимума за счет присоединившихся к белку молекул морфина.

Соотношение исходных компонентов (1:10: — 1:2:1) в реакции конъюгирования выбрано в таких пределах, что получают коньюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 11 до 20 молекул морфина на молекулу белка. При меньшем количестве морфина в конъюгированном антигене ухудшаются его антигенные свойства, при замещении большем, чем 20 молекул морфина на моль белка, ухудшается растворимость конъюгированного антигена.

Выбранный интервал рН (8 — 9) позволяет проводить реакцию с достаточной скоростью при стабильности белкового антигенного носителя.

В предлагаемом способе по сравнению с известным достигается значительное упрощение технологии (проведение технологии в одну стадию, без очистки и выделения промежуточных продуктов. исключение целого ряда реактивов и растворителей, убыстрение процесса примерно в 20 раз) .

Это стало возможным в результате ис1123704

Составители О. С ко!)од мова

Техрсд И. Всрес Корректор М.,1еоитюк

Тираж 68Т Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 415

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор И. Касарда

Заказ 803638 пользования друтого приема получения реакционноспособного производного морфина и другого типа реакционноспособного производного.

Установлено, что антигенные свойства полученного продукта не уступают свойствам конъюгированных антигенов, полученных известным способом.

Пример 1. К раствору 10 мг феррицианида калия в 0,5 мол воды добавляют раст- 1О вор 10 мг хлоргидрата морфина в 1 мл воды и раствор 100 мг бычьего сывороточного альбумина в 2 мл воды. Полученную реакционную смесь выдерживают в течение

2-х ч при 25 С, поддерживая рН 8 добавлением 10о/р-ного раствора гидроокиси натрия. Реакционную массу хроматографируют на колоннах с сефадексом G-25 и сооирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене морфин-бычий сывороточный аль бумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 11 молекул морфина.

Пример 2. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного альбумина получают конъюгированный антиген морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой альбумина ковалентно связаны !3 молекул морфина.

Пример 8. К раствору 10 мг феррициани- 30 да калия в 0,5 мл воды добавляют раствор

10 мг хлоргидрата морфина в мл воды и раствор 20 мг бычьего сывороточного аль бумина в 2 мл воды. Полученную реакционную массу выдерживают при 10 С в течение 1 ч, поддерживая рН 9 добавлением

10о/о-ного раствора едкого натра. Реакционную массу хроматографируют на колонках с сефадексом G-25 и собирают белковую фракцию. Спектрофотометрически устанавливают, что в конъюгированном антигене 4Q морфин-бычий сывороточный альбумин с одной молекулой белка ковалентно связаны 20 молекул морфина.

Пример 4. По указанной методике при использовании в качестве антигенного носителя человеческого сывороточного альбумина получают конъюги рова нный анти ген морфин-человеческий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 22 молекулы морфина.

Анти генные свойства конъюги рова нного антигена морфин-белок, полученного в примере 1, исследовали на кроликах. Для этого 5 кроликов массой 2 кг иммунизировали конъюгированным антигеном морфин-белок внутримышечно по 25 мг/кг 2-3 раза в неделю в течение 6 недель (аналогичным образом проводилась иммунизация и в известном способе) . В сыворотке крови животных определяли наличие антител к морфину реакцией пассивной гемагглютинации и торможения пассивной гемагглютинации, как и в способе-прототипе. Было установлено, что в сыворотке крови иммунизированных кроликов имеются антитела на весь конъюгированный антиген, причем их титры были высокими и составляли в зависимости от индивидуальности животного 1:2560-1:

;10240. При введении в реакционную среду морфина в концентрации 0 М, титр антител снижается до 1:!28 — 1:256. Следовательно, полученный конъюгированный антиген морфин-белок обладает антигенными свойствами, так как он индуцирует у животных синтез антител, специфичных к морфину.

Антигенные свойства полученного конъюгата не уступают, а даже в некоторой степени превосходят анти генные свойства конъюгата, полученного в известном способе, так как там были получены титры антител на весь конъюгат 1:2560, а при добавления морфина он снижается до 1:320.

Технико-экОнОмичесг ая эффективность от .использования предлагаемого изобретения заключается в прощении процесса получения конъюгированны; анти генов на основе морфина, который проводится в одну стадию и не требует использования такого токсичного ве;цества как бензидин.