Способ получения питательной среды для производства биомассы @ @

Способ получения питательной среды для производства биомассы @ @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ .СРЕДЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОМАССЫ BACILLUS MUCILAGINOSUS, содержащей минеральную основу и органические источники питания, отличающийс я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и уменьшения себестоимости среды, в качестве минеральной основы и органических источников питания используют гидролиэат вермикулитовой подстилки, упртреблявш1йся на птицефабрике, содержащий 35,7-36,0-мг.% аминоазота, и нейтрализуюего 20%-ным раствором NaOH до рН 7,37-7,6... сл с

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ KOMHTET СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3573601/28-13 (22) 31.03.83 (46). 15.11.84. Бюл. У 42 (72) Е.Я. Виноградов, М.М. Короткова, В.И. Баланин, С.Н. Хохрин, А.Ф. Кузнецов, Т.В. Севрюгина и А.В. Смородинов (71) Ленинградский ветеринарный институт и Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера (53) 663.15(088.8) (56) 1 ° Иерусалимский Н.Д. Основы физиологии микробов. М., 1963, 2.,Матусевич В.Ф. Силикоз сельскохозяйственных животных. Хмельницкий, 1958.

3. Wallace P.G. Lambeth V.N. Vermiculite-perl iteclay mixturus as container growth media. Con. J. Plant

Sci, 1975, 55, N 3, 771-774.

„.SUÄÄ 1124029 А зш С 12 и 1/20; С 12 R 1/07 (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ

СРЕДЫ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА БИОМАССЫ BACILLUS MUCXLAGINOSUS содержащей минеральную основу и органические источники питания, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и уменьшения себестоимости среды, в качестве минеральной основы и органических источников питания используют гидролизат вермикулитовой подстилки, употреблявшийся на птицефабрике, содержащий 35,7-36,0 мг.7. аминоазота, и нейтрализуют его 207.-ным раствором

Na0H до рН 7,37-7,6.

1 11240

Изобретение относится к промышленной микробиологии, в частности к получению биомассы Bacillus muci. loginosus, которая все шире находит применение в различных областях на5 родного хозяйства: в качестве добавки к корму при кормлении телят, для очистки сточных вод, для получения смазывающего материала, для изготовления бетонных и железобетонных изделий и т.д.

Известны питательные среды (1) на мясной основе: мясопептонный бульон (простой), мясопептонный агар, содержащие, мас.X: углерод 18-21, азот 17-21, фосфор 10-12, минеральные вещества 30-35 и другие компоненты 11-25.

Недостатками плотных и жидких питательных сред на мясной основе являются их высокая стоимость (1 л -.

5 руб. 50 коп.) и дефицитность сырья.

Известны питательные среды на ми" ,,неральной основе . среда Матусевича, А-27, А-54 и другие, содержащие мел, сахарозу, апнатит, стеклянную пудру или железную руду, мясопептонный агар (не более 10X) или агар и другие компоненты (2 ;

Недостатками питательных сред на минеральной основе являются много30 компонентный еостав, длительность культивирования (4-5 сут), незначительный выход биомассы, большое количество отходов отработанной среды.

Наиболее близким техническим решением к изобретению является использование смеси вермикулнта, перлита . и глины в качестве субстрата для выращивания томата при добавлении небольших доз азота $3).

Таким образом, известные питательные среды, широко применяемые в лабораторной практике, использовать в промышленном масштабе нерентабельно из-за их высокой стоимости, дефицит- "5 ности или длительного процесса выращивания ВасП1us mucilaginosus. Поэтому актуальным является поиск более дешевых основ питательной среды для производства биомассы Bacillus

mucilaginosus.

Цель изобретения — увеличение выхода целевого продукта н уменьшение себестоимости среды.

Поставленная цель достигается 55 тем, что, согласно способу получения питательной среды для производства биомассы Bacillus mucilaginosus, со29 2 держащей минеральную основу и органические источники питания, в качестве минеральной основы и .органических источников питания используют гидролизат вермикулитовой подстилки, употреблявшийся на птицефабрике, содержащий 35,7-36,0 мг X аминоазота, и нейтрализуют его 20Х-ным раствором МаОН до рН 7,37-7,6.

Средний образец пробы для получения основы питательной среды составлен из 20 отдельных выемок подстилочного материала из разных секций и различной глубины подстилочного слоя.

Общая масса подстилки, взятой для приготовления питательных сред, составляла 400 г. Для приготовления основы подстилочный материал после использования, имеющий внд увлажненного сьнгучего вещества, заливают водопроводной водой из расчета 100 r на 2 л воды, экстрагируют органические вещества в течение 3 ч при .комнатных условиях. Затем фильтруют через бумажный фильтр и получают прозрачную жидкость темно-соломенного цвета, которую стерилизуют в автоклаве при 1 атм 30 мин. Полученный таким образом питательный субстрат имел следующую характеристику . (табл, 1}., Т аблица 1

Среда Общий Аминный Хлори- рН азот N., азот NH » X мг.X мг.Х

Водный экстракт из отработанного вермикулита 250

37, 77 О, 798:.ф„З.

Перед опытом рН доводят до 7,5..

Критерием оценки пригодности среды для культивирования Bacillus mucilaginosus служит количество сухой биомассы, полученной из 100 мп среды..

Для посева используют микробную взвесь суточной агаровой культуры

Bacillus mucilaginosus, содержащую

0,5 млрд. микробных клеток в 1 мл. Все опыты ставят в 3-кратной повтор íeðñòH. Инкубирование проводят при

3 1124029 . 4

37 С в течение 21 ч. Затем культураль- центрифужных стаканчиках и опреденую жидкость центрифугируют при ляют сухую массу.

6 тыс. об/мин в течение 20 мин. Над- B табл.2 представлены различные осадочную жидкость сливают, а оса- способы подготовки основы питательной док высушивают непосредственно в 5 среды.

Таблица 2

Граничный выход сухой биомассы со

100 мл среды, мг

Кратность использования среды

Метод приготовления

Coci.ав среды

Опыт

20-30

Экстракт из подстилки Экстрагиро- Однократное ванне с добавкой 0 5Х сахароэы

То же

40-50

40-50

То же с добавкой 20

ИПБ

45-100

2 Гидролизат из подстилки Кислотный гидролиз

3 То же, разведенный водой до содержания в среде

36,0 мг. NH То же

30-56

Пятикратное . 210-285 4 Гидролизат из подстилки

230-270

5 То же

Как видно из табл.2, граничные значения выхода биомассы находятся в прямой зависимости от разных факторов: от методики приготовления аредн (экстрагирования или.кислотного гид- 40 ролиза); от добавки в среду дополнительных компонентов (сахарозы или мясопептонного бульона); от кратности непользования среды (одно- или пятикратно); от разведения среды во- 45 дой.

Эта зависимость имеет большой ди. апазон, о чем можно судить по выходу биомассы со 100 мл среды, он состоит в пределах от 20 до 285,мг. 50

Питательная среда, приготовленная по данному способу, может быть использована для получения биомассы при культивировании различных штаммов ЯСарЬ 1ococcus aureus. Wood, Ga 55

Cowen и т.д.,Staph_#_occus alleur

UE ° coll., Другие виДы микроорганизмов не изучались, так как в основе! технического решения речь идет о создании дешевой питательной среды для производственных целей получения биомассы Bacillus mucilaginosus. Штаммовая принадлежность Bagillus

mucilagieosus состояла из штаммов .

ВКМВ-1446-Д, ВКМВ1452-Д, ВКМВ-1462-Д, BKNB-1451-Д, N-2 и А.

Пример 1. 100 г использованного вермнкулита (подстилочного материала) заливают 2 л водопроводной воды. Эту смесь экстрагируют при ь

4 С двое суток.

Аминный азот смеси равен

44,32 мг. X. К этой смеси дабавляют

1,5Х-ную ° HCf (рН 1,3; 30 мл на

2 л смеси). Режим гидролиза: 30 мин обогрев и 30 мин автоклавирование при 1 атм. Смесь после гидролиза нейтрализуют 20Х-ным NaOH до рН 7,3 и фильтруют. Полученный таким образом субстракт имеет следующую характеристику (табл. 3).

1124029

Таблица 3

Общий азот N, вмг Х

Аминный азот NH, мг Ж

Хлориды, Ж

Среда

Степень расщепления, 7. рН

Кислотный гидролизаг

66,36 875,0

0,992

7,58

7,3

Таким образом, при обычном экст- рагировании аминоазота было l5

37,27 мг М, а гидролиз позволяет получить 68,63 мг 7., т.е. в 1,9 раэ больше.

Все остальные операции по изуче-нию эффективности кислотного гидро- 20 лиза проводят аналогично примеру 1.

Полученные данные представлены в табл. 4.

Таблица 5

Таблица 4 25

Сухая масса, Состав среды и количество, мл

Опыт мг

Сухая масса, мг

Состав среды и количество, мл

Опыт

Среднее арифметическое

Среднее арифметическое трех опытов трех опытов

35 1 (конт- Иясопептонный роль) бульон 100

Иясопептонный бульон 100

1 (контроль) 25

Кислотный перевар 100

Кислотный перевар 100 и

0,5 r сахарозы

Гидролизат 50 50

Дистиллированная вода 50

45 4

Кислотный перевар 80

Гидролизат 25

Иясопептонный бульон 20

Дистиллированная вода 75 45

В рецепт среды не вводится дополнительно NaCl, а в примере 2 она вводится дополнительным компонентом.

55 Обусловлено это тем, что среды, Полученные экстрагиронанием и кислотным гидролизом, содержат большое количество хлоридов (табл.1 и 3).

Из табл. 4 видно, что гидролизный субстрат во всех указанных опытах дает выход биомассы Bacillus mucilaб

ginosus в 2-4 раза больше в сравнении с контролем.

Пример 2. Исходный кислотный перевар доводят как и в примере 1

Гидролизат 100 100 до рИ 7,3 и разводят таким образом, чтобы содержание аминного азота составляло 36,0 мг X. Для этого берут

554 .мл кислотного перевара, добавляют 456 мл водопроводной воды и 1 г

NaCl, все остальные операции аналогичны.

Результаты опытов представлены в табл. 5. з

24029 ет влияние на количество получения биомассы.

Но большинство микроорганизмов не является солелюбивыми и повышение концентрации NaCl сказывается на рост и размножение.

Пример 3. Навеска отработанного вермикулита (подстилочный материал) составляет 200 r. Ee эали-.

10 вают 4 л водопроводной воды, т.е. соотношение сухого вещества к воде такое же, как и в предылущих примерах. Аминоазота в вытяжке 33,18 мг Х

Смесь после гидролизата нейтрали15 зуют 20Х-ным NaOH до РН 7,55 и фильтруют. Полученный таким образом питательный субстрат имеет следующую характеристику (табл. 6).

Т а б л и ц а 6

Степень рас щепления, Х

Аминный Хлориды азот ИН2в мг Х

Общий азот N, Х

Среда

Кислотный гидролизат

18,56

1,105 7,55

78,89

425,0

Таким образом, при кислотном гидРолиэе: с увеличением времени гидролиза содержание аминоазота в гидролизате увеличилось, т.е. увеличилась степень расщепления до 18,56Х,>5 что позволяет получить питательного субстрата в 2,2 раза больше в сравнении с обычным экстрогированием.

Исходный кислотный гидролизат (перевар) доводят до рН 7,55 и pasводят таким образом, чтобы содержание аминоазота составляло 35;34 мг %, для этого берут 455 мл кислотного гидролизата и добавляют 545 мл водопроводной воды, NaC1 не добавля- . 45 ют. Все остальные операции по изучению эффективности гидролизата про. водят как указано в примерах 1 и 2.

7 11

Пример 2 отличается тем, что полученный гидролизат разбавляют водой (554 мл кислотного перевара

+456 мл водопроводной воды). Такое разведение уменьшает количество хлоридов, которое и компенсируется добавочным введением NaCl.

В примере 3 NaC1 не добавляли изза того, что в полученном гидролизате содержалось 1,105Х хлоридов (табл. 6).

Для культивирования Bacillus

muciloginosus.можно было и в примере

3 добавить. NaCl, .так как они относятся к галофитам и их оптимальная граница к NaC1 лежит в пределах 1-2Х, при наличии в среде больше или меньше этой концентрации ИаС1 оказыва-!

Дополни-ельной операцией является то, что на этой среде проводят культивирование не разовое, как указано в примерах 1"3, а одну и ту же среду используют пятикратно, т.е. после 21 ч, культивирования биомассу осаждают центрифугирова- нием, высушивают и определяют сухую массу, а надосадочную жидкость внось засевают культурой Bacillus

mucilaginosus и инкубируют, так повторяют пятикратно. После 5-гго культивирования от 100 мл исходной среды остается 50 мл, такой расход среды не позволяет проводить дальнейшее сравнительное исследование.

Полученные результаты представле— ны в табл. 7.

1 1 24029

Таблица 7

Опыт

Состав и количество среды, MJI

Сухая масса, мг

Культивирование

Среднее арифметическое

Суммарное количество, 1 мг

2 3+ 4 .5.1 (контроль) Мясопептонный бульон 100 20 40 50 30 30 170 ю

2 Кислотный перевар 100 30 40 70 40 30 210.34

1

Кислотный перевар 100

0,5 r сахарозы

80 20 30 30 40 200

Кислотный перевар 80

| и мясопептонный бульон 20 65 40 130 30 20 285

57 н

Культивирование совпало с ныходными днями, экспозиция 48 ч. с

Таблица 8

Сухая биомасса, мг

Опыт

Кислотный перевар, мл

3 культивирование

1 культивирование 2 культирование масса средний опыта показатель масса средний опыта показамасса средний опыта показатель тель

40

100

40 40,0

56,6

100

50 46,6

100

50

° П р и м .е р 4. Для многократного использования кисЛотного перевара, описанного в примере 1, все операции проводят аналогично примеру 3, без добавок в кислотный гидролизат..

После 5-го культивирования 0Т исходной 100 мл среды остается 50 мл„.

25 что не Позволяет проводить дальнейжее сравнительное исследование. Остаточный аминоазот еще высокий

66,36 мг Е, но происходит понижение рН 5,3.

ЗО Результаты полученных данных представлены в табл. 8.

1124029

Продолжение табл.8

Средний показатель5 опытов

Суммарное количеет5 культивирование во культивирование асса средний пыта показатель средний показатель масса опыта

270

100

2 . 100 90

260

20

230

20

%

Культивирование 48 ч.

Составитель ф. Кононков

Редактор М. Дырин Техред С.Мигунова Корректор З. Гирняк

Заказ 8208/24 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Приготовление питательных сред (субстрата) для культивирования

Bacillus muciloginosus во всех опытах (из вытяжки и кислотных гидролизатов) проводилось по минимальному содержанию в них аминоазота, которое . равнялось .35,77 — .36,0 мг 7., .т.e. почти в 3 раза меньше, чем в пительном бульоне Хоттен- гера.

Многократное культивирование на предлагаемой среде (пример 4 и 5) позволяет значительно повысить количество выхода биомассы без дополнительных расходов на приготовление питательного субстрата.