Способ определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами

Способ определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением редепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125%, а связующую способность N (моль/мг) определяют по формуле N Ai-A- С где А - радиоактивность стероидного гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов; А, радиоактивность стероидных i гормонов в пробе с добавлением нерадиоактивных стеро (Л идных гормонов; количество белка в осадке i С после добавления протаминсульфата; В удельная радиоактивность стероидного гормона. iNd 4 Ю 1C VI

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК,С 01 М 33/48 зов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАМ изОБРетений: и ОтнРытий

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3514406/28-13 (22) 22. 11. 82 (46) 15. 11.84. Бюл. Р 42 . (72). В.Г. Дегтярь, Н.Е. Кушлинский и Ю.В. Милосердов (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (53) 612.398(088.8) (56) 1.Steggles А.W., King R,I.В.

The use of Protainine to study

67-ЗН-Oesteadiol-178 Binding in Rat

Uterus. — "Biochim 3", 1970, 118, р. . 695-701. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ

СО СТЕРОИДНЬКИ ГОРИОНИЯ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, о т л и„,Я0.„1124227 А ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08 -0,125Х, а связуницую способность N (моль/мг) определяют по формуле

N А -А

С В где А — радиоактивность стероидного

1 гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;

A - радиоактивность стероидных гормонов в пробе с добавлее нием нерадиоактивных стероидных гормонов;

С вЂ” количество белка в осадке 1 после добавления протаминсульфата;

 — удельная радиоактивность стероидного гормона. )иии

I 1124227

Изобретение относится к биохимии r стероидных гормонов и может быть использовано для количественного определения связывающей способности рецепторов стероидных гормонов в разных тканях, преимущественно в тканях органов-мишеней.

Способ количественного определения белка имеет важное значение при исследовании рецепторов стероидных гормонов, так как используется для вычисления связывающей способности этих рецепторов к стероидам в большинстве методов их определения в тканях. 15 !

A A

Известен способ определения свя.зывающей способности рецепторных белков со стероидньпли ормонами.)1), Однако. белки — рецепторы составляют лишь незначительную часть суммарных белков цитозольной фракции и известный способ не позволяет. провести количественное определение рецепторных белков стероидных гормонов, поэтоьлу вычисление связывающей способности с использованием суммарного белка не точно отражает связывающую способность рецепторов стероидных гормонов. Кроме того, при определении белка по известному способу невозможно учесть. вклад, . который вносят белки крови, присутствующие в тканях животных и особенно человека (эбиопсийный материал, удаление тканей при операциях) в

35 значительных количествах.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается

4О тем, что согласно способу определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного

45 гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом дополнительно определяют белок

59 к осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125, а связывающую способность N (моль/мг) опрецеляют по формуле

2 де А — радиоактивность стероидного л гормона в ."робе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;

А, — радиоактивность стероидного гормона в пробе с добавлением нерадиоактивньм стероидньм гормонов;

С вЂ” количество белка в осадке после добавления протаминсульфата;

 — удельная радиоактивность стероидного гормона.

Способ осуществляют следующим образом.

К части цитозольной фракции добавляют раствор протаминсульфат:" в буфере, чтобы получнть конечную концентрацию протаминсульфата в растворе 0,08-0,i25 . Образующийся осадок центрифугируют и промывают дополнительно исходным раствором протаминсульфата, а затем растворяют в минимальном объеме ледяной уксусной кислоты.К раствору рецепторньм белков в ледяной уксусной кислоте добавляют водный концентрированпый раствор едкого натра для нейтрализации уксусной кислоты до

pEI 8,0-8,5". Объемы уксусной кислоты и концентрацию раствора едкого натра выбирают с таким расчетом, чтобы конечный объем, используемый для определения белка, соответствовал методике определения белка.

Количественное определение белка предлагаемым способом проверено на цитозольных фракциях тканей рака . молочной железы, рака и аденомы предстательной железы, матки и вентральной простаты крыс линии Вистар весом

120-130 г.

Пример 1.Ткань (рак.молочной железы человека) измельчали в ступке при охлаждении жидким азотом, ! смешивали с буфером (состав буфера:

10 моль/л трис-НСь; 1,5 моль/л ЭДТА, 1 моль/л дитиотрейтола и 0,3% азида натрия, рН 7,4 при 20 С,10 об.% глицерин в соотношении (4-10)."1 (объем буфера в миллилитрах, вес ткани в граммах). Центрифугируют после размораживания 10 мин при 2500-3000 g, затем надосадочную жидкость центрифугируют при 105000 д 60 мин. К

100 мл полученного цитозола добавляют равный обьем О» 16-0,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере.

Составитель E. Житникова

Редактор Л.Пчелинская Техред)К.Кастелевич Корректор И. Эрдейи

Заказ 8272/34 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород; ул. Проектная, 4

Э I

Смесь инкубируют 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 2500-3000 g, при этом белки — рецепторы стерондных гормонов отделяют в виде осадка.

Недостаточную жидкость;отбрасывают, а осадок промывают не менее 2-х и не более 4=х раз 1,0 мп охлажденного

0,08-1,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере без днтиотрейтола.

Промытый осадок растворяют в нормальньм условиях в 40-60 мл ледяной кислоты, добавляют эквивалентное, количество 40-60Х-ного раствора едкого натра и количественно определяют белок по методу Лоури. Кон-. центрация белка для указанной ткани составляет 3-67 °

Величина связывающей способности белка исследуемой ткани молочной железы КО (Нз) 5oL-дигидротестостероид равна 16 фемтомоль/мг.

Пример 2. К пробам цитозола, полученного из ткани аденомы предстательной железы человека анало-гично примеру 1, добавляли равный

124227 объем раствора протаминсульфата с разной концентрацией, осадок в пробах обрабатывали и количественно определяли белок аналогично примеру

1. Связывающая, способность белка к, (Н 3 5 -дигидротестостерону исследуемой ткани составила 12 фемтомоль/мг белка.

Использование предлагаемого cnocojp ба определения рецепторных белков стероидных гормонов в цитозольной фракции тканей животных и человека после осаждения протаминсульфатом позволяет точно количественно определять рецепторные белки стероидных гормонов цитозольной фракции тканей животных и человека в результате исключения влияния белков и белков цитозольной фракции тканей, не осаж2р даемых протаминсульфатом, на количественное определение белка, что обеспечивает более точное вычисление связывающей способности цитозольных рецепторов стероидных гормонов

25 по отношению к стероидам.