Способ определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением редепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125%, а связующую способность N (моль/мг) определяют по формуле N Ai-A- С где А - радиоактивность стероидного гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов; А, радиоактивность стероидных i гормонов в пробе с добавлением нерадиоактивных стеро (Л идных гормонов; количество белка в осадке i С после добавления протаминсульфата; В удельная радиоактивность стероидного гормона. iNd 4 Ю 1C VI

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК,С 01 М 33/48 зов

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАМ изОБРетений: и ОтнРытий

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3514406/28-13 (22) 22. 11. 82 (46) 15. 11.84. Бюл. Р 42 . (72). В.Г. Дегтярь, Н.Е. Кушлинский и Ю.В. Милосердов (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (53) 612.398(088.8) (56) 1.Steggles А.W., King R,I.В.

The use of Protainine to study

67-ЗН-Oesteadiol-178 Binding in Rat

Uterus. — "Biochim 3", 1970, 118, р. . 695-701. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ

СО СТЕРОИДНЬКИ ГОРИОНИЯ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, о т л и„,Я0.„1124227 А ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08 -0,125Х, а связуницую способность N (моль/мг) определяют по формуле

N А -А

С В где А — радиоактивность стероидного

1 гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;

A - радиоактивность стероидных гормонов в пробе с добавлее нием нерадиоактивных стероидных гормонов;

С вЂ” количество белка в осадке 1 после добавления протаминсульфата;

 — удельная радиоактивность стероидного гормона. )иии

I 1124227

Изобретение относится к биохимии r стероидных гормонов и может быть использовано для количественного определения связывающей способности рецепторов стероидных гормонов в разных тканях, преимущественно в тканях органов-мишеней.

Способ количественного определения белка имеет важное значение при исследовании рецепторов стероидных гормонов, так как используется для вычисления связывающей способности этих рецепторов к стероидам в большинстве методов их определения в тканях. 15 !

A A

Известен способ определения свя.зывающей способности рецепторных белков со стероидньпли ормонами.)1), Однако. белки — рецепторы составляют лишь незначительную часть суммарных белков цитозольной фракции и известный способ не позволяет. провести количественное определение рецепторных белков стероидных гормонов, поэтоьлу вычисление связывающей способности с использованием суммарного белка не точно отражает связывающую способность рецепторов стероидных гормонов. Кроме того, при определении белка по известному способу невозможно учесть. вклад, . который вносят белки крови, присутствующие в тканях животных и особенно человека (эбиопсийный материал, удаление тканей при операциях) в

35 значительных количествах.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается

4О тем, что согласно способу определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного

45 гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом дополнительно определяют белок

59 к осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125, а связывающую способность N (моль/мг) опрецеляют по формуле

2 де А — радиоактивность стероидного л гормона в ."робе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;

А, — радиоактивность стероидного гормона в пробе с добавлением нерадиоактивньм стероидньм гормонов;

С вЂ” количество белка в осадке после добавления протаминсульфата;

 — удельная радиоактивность стероидного гормона.

Способ осуществляют следующим образом.

К части цитозольной фракции добавляют раствор протаминсульфат:" в буфере, чтобы получнть конечную концентрацию протаминсульфата в растворе 0,08-0,i25 . Образующийся осадок центрифугируют и промывают дополнительно исходным раствором протаминсульфата, а затем растворяют в минимальном объеме ледяной уксусной кислоты.К раствору рецепторньм белков в ледяной уксусной кислоте добавляют водный концентрированпый раствор едкого натра для нейтрализации уксусной кислоты до

pEI 8,0-8,5". Объемы уксусной кислоты и концентрацию раствора едкого натра выбирают с таким расчетом, чтобы конечный объем, используемый для определения белка, соответствовал методике определения белка.

Количественное определение белка предлагаемым способом проверено на цитозольных фракциях тканей рака . молочной железы, рака и аденомы предстательной железы, матки и вентральной простаты крыс линии Вистар весом

120-130 г.

Пример 1.Ткань (рак.молочной железы человека) измельчали в ступке при охлаждении жидким азотом, ! смешивали с буфером (состав буфера:

10 моль/л трис-НСь; 1,5 моль/л ЭДТА, 1 моль/л дитиотрейтола и 0,3% азида натрия, рН 7,4 при 20 С,10 об.% глицерин в соотношении (4-10)."1 (объем буфера в миллилитрах, вес ткани в граммах). Центрифугируют после размораживания 10 мин при 2500-3000 g, затем надосадочную жидкость центрифугируют при 105000 д 60 мин. К

100 мл полученного цитозола добавляют равный обьем О» 16-0,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере.

Составитель E. Житникова

Редактор Л.Пчелинская Техред)К.Кастелевич Корректор И. Эрдейи

Заказ 8272/34 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород; ул. Проектная, 4

Э I

Смесь инкубируют 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 2500-3000 g, при этом белки — рецепторы стерондных гормонов отделяют в виде осадка.

Недостаточную жидкость;отбрасывают, а осадок промывают не менее 2-х и не более 4=х раз 1,0 мп охлажденного

0,08-1,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере без днтиотрейтола.

Промытый осадок растворяют в нормальньм условиях в 40-60 мл ледяной кислоты, добавляют эквивалентное, количество 40-60Х-ного раствора едкого натра и количественно определяют белок по методу Лоури. Кон-. центрация белка для указанной ткани составляет 3-67 °

Величина связывающей способности белка исследуемой ткани молочной железы КО (Нз) 5oL-дигидротестостероид равна 16 фемтомоль/мг.

Пример 2. К пробам цитозола, полученного из ткани аденомы предстательной железы человека анало-гично примеру 1, добавляли равный

124227 объем раствора протаминсульфата с разной концентрацией, осадок в пробах обрабатывали и количественно определяли белок аналогично примеру

1. Связывающая, способность белка к, (Н 3 5 -дигидротестостерону исследуемой ткани составила 12 фемтомоль/мг белка.

Использование предлагаемого cnocojp ба определения рецепторных белков стероидных гормонов в цитозольной фракции тканей животных и человека после осаждения протаминсульфатом позволяет точно количественно определять рецепторные белки стероидных гормонов цитозольной фракции тканей животных и человека в результате исключения влияния белков и белков цитозольной фракции тканей, не осаж2р даемых протаминсульфатом, на количественное определение белка, что обеспечивает более точное вычисление связывающей способности цитозольных рецепторов стероидных гормонов

25 по отношению к стероидам.