Способ получения фосфолипазы @

Способ получения фосфолипазы @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces clnnampmeus, включающий диализ и последую14ую хроматографию, отличающийс я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевления способа, хроматографию проводят на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-НС1 буфером с рН 7,9-85,1 содержащим 1,4-1,6 М хлористый натрий. О)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

00UHVI

РЕСПУБЛИН

09) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3575292/28-13 (22) 07.04.83 (46) 23.11.84. Бюл. У 43 (72) И.К.Стрейкувене, Г.Ю.Некрашайте, В.В.Кулане и А.-С.А.Глемжа (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (53) 577.15(088Л) (56) 1. 0kava Y, Yamaguchi T.

Studies on phospho1ipases from

Streptomyces .II. Purification and

propertiey of Streptomyces hachijoensis phospholipase P.-"J.Biochem.", 1975, Ф 2, т.78, с. 363-372.

2 ° Стрейкувене И.К., Некрашайте Г.И. и другие. Хроматография фосфолипазы D. Streptomyces cinnamomeus на аминоалкилзамещенных сефарозах.

"Прикладная биохимия и микробиология". T. l 8,,вып. 1, 1982, с. 41-47. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПА.ЗЫ D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus, включающйй диализ и последующую хроматографию, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевления способа, хроматографию проводят на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мИ трис-НС1 буфером с рН 7,9-8 1 содержащим

1,4-1,6 М хлористый натрий.

Ф 1252

Изобретение относится к микробио. логической промьппленности, точнее к способам получения и очистки ферментных препаратов, и может быть использовано в технологии производ-. ства высокоочищенных ферментов.

Известен способ очистки фосфолипазы D из Streptomyces hachij oensis, включающий хроматографирование фильтрата культуральной жидкости на ДЭАЭ- 10 целчюлозе, лиофилизацию, гельфильтрацию через сефадекс Г-50, лиофилизацию и препаративное изоэлектрофокусирование. Выход фосфолипазы D составляет 53,3Х от активности фильт- 15 рата культуральной жидкости, удельная активность 630 ед/мг белка

1за . единицу активности фосфолипазы

Ю принимают количество фермента, отщепляющее IjuM этанбйамина за 20 ! мин при 37 С) )I) .

Недостатками этого способа являются многостадийность и применение препаративного изоэлектрофокусирования на заключительной стадии очистки. Препаративное изоэлектрофокусирование является сложным методом, требующим дорогостоящей . импортной аппаратуры, à последующая

1 отмывка препарата фермента от амфолинов ведет к снижению фермен тативной активности и препятствует его применению для получения больших . количеств высокоочищенной фосфолипазы 3 .

46 3 фосфолипазной активности на 1 r сорбента P) .

Недостатками известного способа являются невысокий выход и удельная активность целевого продукта, а также высокая стоимость полученной фосфолипазы I}, так как для выделения фермента необходимо синтезировать специальный сорбент.

Целью изобретения является увеличение выхода и удельной активности целевого продукта, а также удешевление способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фосфолипазы D из бесклеточной культуральной жидкости Streptomyces cinnamomeus,,включающему .диализ и последуюп ую хроматографию, хроматографию проводят на силохроме С-80, содержащем силанольные группы, осуществляя элюцию целевого продукта 8-12 мМ трис-HCI буфером с рН 7,9-8,1, содержащим 1,4-1,6 M хлористый натрий.

Сущность способа заключается в том, что хроматографию проводят на колонке с силохромом С-80, содержащим силанольные группы и характеризующимся удельной поверхностью 7090 м /r, диаметром пор 400-500 А, 2 о объемом пор л.1,2-1,4 см /г, размером зерен 80-160 мкм,.неправильной формой зерен. При хроматографии диалиэата культуральной жидкости на этом сорбенте сорбированная фосфолипаза элюируется 8-12 мМ трис-НС! буфером, содержащем 1,4-1,6 М NaC1,) при рН 7,9-8,1.

Пример 1. Способ очистки фосфолипазы 3 из культуральной

RHgKocTH Streptomyces cinnamomeus в оптимальных условиях.

Получение бесклеточной культуральной жидкости, содержащей фосфолипазу3 . Продуцент фосфолипазы

D.Streptomyces cinnamomeus шт. 1102 С культивируют на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: соевая мука 30; фруктоза 1; КН РО 2;

NH4Cl 3, при рН 7,2 в течение 48 ч при 30 С и скорости вращения качалки о

-1

2,5 с . Клетки микроорганизмов отделяют центрифугированием при

12000 Х g и температуре 2 С в течение 30 мин.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения фосфолипазы П из бесклеточной культуральной жидкости

Streptomyces cinnamomeus, включающий . высаливание бесклеточной культуральной жидкости сернокислым аммонием до 80Х-ного насыщения с последующим диализом против 20-ти кратного объема IO MM трис- 1С! буфера рН 8,0> содержащего 1 М НаС1, в течение 18 ч при 4 С и хроматографию на нонилО

Г аминооксипропилсефарозе. Выход фермента 54Х от общей активности фосфолипазы 3 в культуральной жидкости, удельная активность препарата

1700 ед/мг белка(за единицу активности фосфолипазы 3 принимают количество фермента, которое выделяет 1 р 9 титруемых щелочью кислот за 1 мин при 37 Ср Сорбционная емкость нонилО аминооксипропилсефарозы !300 ед.

Диализ. Бесклеточную культуральную жидкость в объеме 34 мл диализируют против 10 мМ трис-110! буфсра рН 8,0

5246

Сорбция фосфо-.

Условия сорбции

Условия элюции

Элюция липазы по акУдельная активность. мкг.экв/мг рН

Молярность

NaC1, мМ, Молярность буфера, мМ

Выход по акрН тивности, в процентах от нанесенной тивности,X.100

1,4 7,9

83

2567

1 5 8,0 2664

8,0

100

90

2187

8,1

1,6 8,1

Составитель И.Привалова

Редактор Н.Джуган Техред С.Легеза Корректор А.Обручар

Заказ 8435/18 Тирай 521. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 112 в течение 18 ч при 4 С. Выпавшйй осадок отделяют центрифугированием при 12000 Х g и 2 С в течение

30 мин. Активность диализата культу ральной жидкости 32,7 ед/мл, белка

0,23 мг/мл, удельная активность

142,2 ед/мг белкафктивность определяют по методу прототипа), Хроматография диализата культуральной жидкости на силохроме С-80.

Хроматографию проводят на стеклянной колонке размером 0,5х5 см, содержащей 0,33 г силохрома С-80, уравновешенного 10 мМ трис-НС1 буфером рН 8,0. Скорость протекания во время сорбции и промывки 0,2 мл/мин. 34 мл диализата культуральной жидкости, содержащего 7,84 мг белка и 1112 ед. активности фосфолипазы 3, накосят на колонку. Несорбированные белки отмывают 50 мл исходного буфера, сорбированную фосфолипазу 3 элюиру-. ют 10 мМ трис-НС1 буфером рН 8,О, содержащим „1,5 М Na01 со скоростью протекания 2,5 мл/мин. Выход фосфоли пазы 3 90,6%, удельная активность препарата 2664 ед/мг белка, П р;и м е р 2. Получение бесклеточной жидкости и диализ проводят по примеру 1. Для сорбции и элюции используют буфер с молярностью 8 или

12 мМ. Выход и удельная активность фосфолипазы при замене 10 мМ буфера

1 на 8 или 12 мМ практически не изменяется. Влияние рН буфера и молярности

I хлористого натрия на эффективность разделения фосфолипазы Q и примесных белков при хроматографии., га силохроме С-80, приведены в таблице, I

Приведенные примеры показывают, что для достижения положительного эффекта необходимо использовать для элюции

1р 8-12 мМ трис-НС1 буфер с рН 7,9-8,1, содержащий 1,4-.1,6 М хлористый натрий.

Снижение рН буфера приводит к дестабилизации фермента, а увеличение рН не позволяет осуществить сорбцию за счет приближегий к .иэоэлектрической точке(8,44) .

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход целевого продукта а 1,7 раза, а удельную активность в 1,6 раз, по сравнению с известным способом. Следует также отметить, что сорбционная емкость силохрома С-80 в 7 раз выше сорбциоиной емкости нониламинооксипропилсефа-.

25 розы, используемой для очистки фосфо.липазы З по известному способу.

Кроме того, предлагаемый для очистки . фосфолипазы З силохром С-80 является дешевым широкодоступным сорбентом, 30 который можно успешно использовать в технологии очистки больших количеств фосфолипазы 0