Способ получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы
Патент 1125248
Авторы
Способ получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы
Иллюстрации
Реферат
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ, . предусматривающий отделение клеток дакpoopгaйизмoв, их разрушение автолизом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сзпнку, отличающ и и с я тем, что, с целью повьшения удельной активности препарата и получения препарата, не содержащего растворимык микробных веществ, в качестве продуцента используют штамм Actinomyces albogriscQlus 28-3, при этом автолиз клеток микроорганизмов проводят в 0,01-0,10%-ном растворе детергента 65-75 С в течение 0,5-2,0 ч, нераствориьв 1й остаток автолизованных клеток концентрируют до 3-30% сухих веществ, в концентрат добавляют 10-40% от сухих веществ концентрата пищевого белка, a полученные гранулы подсушивают до 50г 70% сухих веществ и подвергают дуб лению глутаровым альдегидом взятым в концентрации 0,2-1,0%.
СО(ОЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИ((6% 01) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3555441/28-13 (22) 27.12.82 (46) 23. 11.84. Бюл.943, 1 (72) Н.C.Ãîëîâèíà, Л.А.Нахапетян, Л М.Вайнер, А.В.Гавристов, В.В.До- рохов, З.Г.Медведев, Л.М.Мельникова и Л h.стрельникова (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (53) 557 . 15(688. 8) (56) t. Патент C9IA (f3779869, кл. 195/68, опублик. 1979.
2. Патент СССР (1712026, кл. С 12.11 11/02, опублик. 1980. (54) (57) СНОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
S Pf(fUfETO 80é fIn0X03OH3mePAm„ . предусматривающий отделение клеток микроорганизмов, их разрушение У(1 С 12 Н 9/92; С 12 N 1/04 автолизом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сушку, о т л и ч а ю щ и.й с я тем, что, с целью повышения удельной активности препарата и получения препарата, не содержащего растворимык микробных веществ, в качестве продуЦента используют штамм Actiаошусев albogriscolus 28-3, при этом автолиз клеток микроорганизмов проводят s 0,01-0, 10Х-ном растворе детергента при 65-75 С в течение
0,5-2,0 ч, нерастворимый остаток автолизованных клеток концентрируют до 3-30Х сухих веществ, в концентрат добавляют 10-40Х от сухих веществ Е концентрата пищевого белка, а полученные гранулы подсушивают до 5070Х сухих веществ и подвергают дублению глутаровым альдегндом,взятым в концентрации 0,2-1,0Х. И
1125248 2
Целью изобретения является повьппение удельной активности препарата внутриклеточной глюкозоиэомеразы и получение препарата, не содержащего растворимых микробных веществ. 40
Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы, предусматривающему отделение клеток микроорганизмов, их раэру-45 шение автолиэом, добавление глутарового альдегида, получение гранул и их сушку, в качестве продуцента используют штамм Actinomyces albogriseolus 28-3, при этом автолиз кле- 50 ток микроорганизмов проводят в 0 010,107.-ном растворе детергента при
65-755С в течение 0,5-.:2,0 ч, нераст воримый осадок автолизированных клеток концентрируют до 3-307 сухих ве- 55 ществ, в концентрат добавляют 10-40% от сухих веществ концентрата пищевого белка, а полученные гранулы подИзобретение относится к фермент- " ной отрасли микробиологической промышленности, а именно к способу получения внутриклеточной глюкозоиэоме— разы. 5
Известен способ-:получения внутриклеточной глюкоаоиэомераэы иэ микроорганизмов рода Mreptomyces путем обработки культуральной жидкости глутаровым альдегидом, фильтрации и сушки Ц, Недостатками данного способа являются относительно невысокая удельная активность препарата глюкозоизомеразы, так как препарат со- 15 ,держит большое количество балластных веществ микробной клетки, а также потеря части активности из-эа диффузионных затруднений, возникающих при прохождении субстрата через 20 неповрежденную клеточную стенку.
Наиболее близким к изобретению по технической сути является способ получения препарата внутриклеточной глюкозоизомеразы, предусматривающий 25 отделение клеток микроорганизмов рода Bacillus, их разрушение механическим путем или автолизом на 25-1007., смешивание с глутаровым альдегидом, Ф взятым в количестве О, l-1,0 мас.ч. З0 на 1 мас.ч. сухих веществ клеточной массы; выдерживание смеси при температуре окружающей среды до образования геля, получение гранул и их сушку (2) . сушивают до 50-70Х сухих веществ и подвергают дублению глутаровым альдегидом, взятым в концентрации
0 2 1р07а °
Способ осуществляют следующим образом.
Клетки микроорганизмов, например, Actinoqryces alborpiscolus 28-3, отделяют от культуральной жидкости и промывают, а затем вносят в количестве
1-57 по сухим веществам в нагретый о до 65-75 С 0,01-0,10Х-ный раствор детергента, имеющий рН 6-,2-6,8 и содержащий 5 ° 10 M хлористого ко5 бальта. Суспензию выдерживают 0,52,0 ч при указанной температуре, затем охлаждают до температуры окружающей среды, отфильтровывают и промывают нерастворимый остаток, представляющий собой концентрат глюкозоизомеразы. При этом происходит потеря до 607 сухих веществ клеток, а удельная глюкозоиэомеразная активность достигает 250-2707, от активности исходных клеток, причем наблюдается увеличение "кажущейся™ актив". ности (до C0%) за счет уменьшения диффузионных затруднений для действия субстрата. Потери глюкозоизомеразной активности с раствором и промывными водами ие превьппают 1Х К концентрату глюкоэоизомеразы с содержанием
3-30% сухих веществ прибавляют пищевой белок (желатин) в количестве 1040Х по сухим веществам концентрата. . (белок может быть прибавлен в виде раствора) . Смесь тщательно перемешивают ,и гранулируют а затеи полученные гранулы подсушивают до 50-707, сухих веществ.
К охлажденному до 4-6 С раствору глуо тарового альдегида, имеющему рН
6,3-7,2 прибавляют подсушенные урану- лы и выдерживают не менее 3 ч при указанной температуре для дубления, а затем отфильтровывают и сушат полученный препарат.
За единицу глюкозоизомеразной активности (ГиА) принимается количество фермента, которое катализирует превращение 1 QN субстрата в продукт о
sa минуту при 70 С, рН 7,0 концентрации субстрата (о-фруктозы) 2 М, содержании ионов магния 5 10 М.
Пример 1. (контроль). 81,8 г влажной биомассы Actinorpyces alhop11sco1Us 28-3 (ГиА 350 ед/г СВ, В 95,30, где  — массовая доля влаги
%), подвергают автолиэу при 25 С
Пример 2
Промывка
Пример 1
Параметр
280
О, 140
О, 155
2, 050
2бО
Содержание белка,мг/л
1881
126
Содержание нуклеиновых кислот, мг/л
0,040
0,040
О, 210
О, 230
2ВО
260
Содержание белка, мг/л
153
Содержание нуклеиновьм кислот, мг/л
0,125
О, 140
260
Содержание белка, мг/л
89
Содержание нуклеиновых кислот, мг/л
28о
Е,О30
О, 040
1У
0. 2бо
Содержание белка, мг/л
16
Содержание нуклеиновых кислот, мг/л
П р и м е ч а н и е: Е2В и F.2 »оптические плотности растворов при 280, и 260 нм соответственно в кювете длиной 1 см.
3 1125248 4 в течение 5 ч (577, ГиА в растворе), еще 1,5 л (П промывка) и, наконец, затем прибавляют 6,4 r 257.-ного раст" еще двумя порциями воды по 1 л (0l б вора глутарового альдегида и 1У промывки), В промывным водах ((),42 мас.ч на 1 мас.ч. сухого ве- определяют оптическую плотность при щества клеточной массы). Через 1,5 ч, 280 и 260 нм, чтобы оценить содержа .образовавшийся гель экструдируют и ние в препарате легко вымываемых вевысушивают полученные гранулы на воз- ществ — компонентОв микробной клетки, духе. в частности, содержание белка и
Полученные 7,7 г препарата промы- нуклеиновых кислот. Результаты опыта вают 1, 5 л воды (1 промывка) затем 1п приведены в табл. 1.
1 а б л и ц а
1125248
Концентрация,X
Время инкубации ч децилсульфата натрия .
0-1
0,03 0,-10
ГиА M ГиА М ГнА M
-«
300
405
80 470 60 556 45 540 53
42 825 40 705
405
90
538
120
4
М вЂ” масса СВ автолизованных клеток в процентах от
После промывки получено 4,7 г прегарата (В 13,2X), при этом потеря массы при промывке 39Х, Активность полученного образца
75 ед / r сухого вещества что составляет 23% от 1 заданной активности;
Максимальная потеря активности из-за перехода части фермента в раст"воримое состбяние наблюдается при обработке биомассы 0,10%-ным раствором цетилпиридинийхлорида.и составляет соответственно 3% (60 мин) и 47 (120 мин). В остальных случаях активность в растворе не превышает
fX от заданной. Обработка 0,03%-ным ., раствором додецилсульфата натрия в течение 120 мин приводит к "кажущемуся" увеличению активности на 10Х, по сравнению с заданной.
Получение препарата внутриклеточ-., I ной глюкозоизомеразы.
К 246 r нерастворимого остатка, полученного после автолиза в 0,07% - ном растворе цетилпиридинийхлорида в течение 1 ч (ГиА 3?8 ед/г СВ, В 97,0%) прибавляют 10 г 107-ного раствора желатина (О, 12 мас.ч. на
1 мас.ч. СВ нерастворимого остатка), перемешивают до гомогенного состояния и получают гранулы экструзией.
Гранулы подсушивают до 507 СВ при
25 С, а затем помещают в 100 мл
Полученный препарат обладает низкой глюкозоизомеразной активностью и имеет большое количество растворимых веществ, для удаления ко5 торых требуется многократная промывка <не менее 0,6 л воды на
1 г препаратap, 100 300 100 300 100 охлажденного до 5 С 17-ного раствора глутарового альдегида, выдерживают 3 ч при 5 С, а затем отфильтроо вывают и промывают 0,5 л воды (1 промывка) и еще тремя порциями воды по 100 мп (П,Ш и 1У промывки) . В про. мывных водах определяют Е и Е
260 (см.табл. 1) . Как видно из результатов, уже после П промывки в .растворе отсутствуют белки и нуклеиновые кислоты (объем промывных вод не более 0,06 л на 1 г препарата) .
После сушки на воздухе при 25 С получено 9,2 r препарата (В 13,0%), при этом потеря массы составляет сколо 5% от исходных сухих веществ.
Активность препарата 245 ед/г СВ, что составляет 707. от заданной в концентрате глюкозоизомеразы и
82Х от активности исходных клеток.
Пример 3. Проведение автоли. за. клеток Actinomyces albopriseolus
28-3 .
К 1800 мл 0,10%-ного раствора додецилсульфата натрия, нагретого до
-5
75 С и содержащего 5 ° 10 М хлористого
1125248
Т а
0,03
0,10
О, 0-1
ГиА М ГиА
100 300
100300 100
300
378 75
670
45 620
670
Пример 2.Проведение автолнза клетокАс пошусез а1Ъо8г зео1из 28-3.
К 1800 мл раствора детергента (pe 6,3), нагретого до 65ОС и содер- . жащего 5 «10 И хлористого кобальта,,прибавляют влажную биомассу (В 94,8Х
ГйА 300 ед/г сухого вещества), переПетилпиридинийхлорида заданной в исходной биомассе (по СВ). кобальта, прибавляют 200 г влажной
° биомассы (В 97,0Х ГиА 300 ед/г СВ), у перемешивают и выдерживают 0,5 ч:3s при -75 С, а затем отфильтровывают нерастворимый остаток и промывают его двумя объемами воды. Активность полученного концентрата глюкозоизомеразы 400 ед/г СВ,.получено 45 г(В 90,0 Х 40 потеря массы. 25Х.) .
Получение препарата внутриклеточной.глюкозоизомеразы.
К 45 г концентрата глюкозоизомера.зы прибавляют 10 мл раствора желатина4 содержащего 0,45 r СВ (0,1 мас.ч. на 1 мас.ч. СВ концентрата} тщательно перемешивают охлаждают до 5 С и
Ф гранулируют. . Гранулы подсушивают до 70Х СВ и поМе- о щают в 50 мл 0,2Х-ного раствора глутарового альдегида,.имеющего рН 6,5.
После выдерживания в течение 12 ч о при 5 С гранулы отфильтровывают, промывают 0,2 л воды и сушат на воздухе.
Получено 5,5 г препарата (В 14, 1X)
ГиА 287 ед/г СВ), выход от заданной мешивают и помещают в териостат при 65 С на определенное время., Затем
Ф ыстро охлаждают и отфильтровывают нерастворимый остаток, его промывают двумя объемами воды., и определяют массу, ГиА и содержание сухих веществ ф4.
Результаты опыта приведены в табл.2. блица 2 активности 75Х, выход от активности исходных клеток 96Х.
Hp и м е.р 4. Для автолиза в
О,ОЗХ-ном растворе додецилсульфата натрия нри 70 С берут 200 r влажо ной биомассы Actinomyees . albogviseolus 28-3 (В 70,0%, ГиА 260 ед/г СВ) на 1800 мп раствора детергента и проводят автолиз в течение 2 ч. Получено
95,8 г концентрата глюкозоизомеразы (В 70,0Х) с ГиА 716 ед/г СВ.
К полученному концентрату глюкозоизомеразы прибавляют 30 мл раствора
Ф желатина, содержащего 9,6 г СВ (0,4 мас.ч. на 1 мас.ч. СВ концентра-. та), перемешивают и гранулируют. Гранулы подсушивают до 60,ОХ CB npu
25 С, а затем,нх подвергают дубЖ-. о нию в 250 мл 0 4Х-ного раствора глута" о рового альдегида при 5 С в течение.
3 ч.
После промывки и сушки на воздухе получено 39,5 г препарата глюкозоизомеразы (В 15,0Х), ГиА 383 ед/г СВ, что составляет 75Х от заданной актив1 125248
Количеств желатина
Выход
Нерастворимый кон центрат
Содер жанне
СВ в концентрате, Х
Пример
Вид и концентрация детергента, Х
ТемпеВремя, ч о удельой акобщий процент от исходного в.процентах к СВ концентрата,X ратура
С дельная активность ед/г СВ масса в процентах от массы
СВ исходных клеивноси про) цент от исходного ток
100
100
100
100
100
100
135
108
0,01
179
182
100
100
100
157
60
2 0,03
110
275
100
100
100
108
135
О;10
185
705
235
2,0
0 — 300
100
100
100
94
126
378
0,01
78
167
500
2,0
100
300
100
100
223
2,0 — 670
Π— 300
1, 5 — 670
0,03
100
100
100
100
223
0, 10 ности и 147Х от активности исходной биомассы.
Обработка детергентом клеток
1 1 l 1
25 5 4 7 350
ДДС 65 О - 300
1,0 - 405
1,5 — 538
2,0 — 546
Π— 300
1 5 — 470
2,0 — 825
Π— 300
0,5 — 405
1,5 — . 556
Снижение температуры приводит к большим Потерям активности глюкозоll 1125248 l2 изомеразы в результате перехода части ратуры выше 75 0 приводит к частичной фермента в раствор. Увеличение темпе-,инактивации глюкозоиэомеразы (табл.3).
Таблица 3
А б 4» «3 т -Ф-
Получение гранулированного препарата
Общий выход в проце тах от римечания
Содержание
СВ в грану лах,Х
Ф
Общий в процентах от акеханиеская прочность исходного тивности исходHbKK клеток
Контроль
23
1,8 +
245 70
1,0 ++
Концент ра ция глутаро . ного ал дегида, Ж
Удельная ак тив« ность ед/г
СВ
ыход по дель.ой актив ности в процентах от.
ГиА обработанньи клеток
Гранулы частично разрушаются при попадании в раствор глутарового альдегида
1125248
14!
Обработка детергеитом клеток
\ 1 3
Приl49P
207
100 .
133
75.О, 10
275
88
113
0,03
85
202
0,03
120
75
0,15
2 5 — 502
3,0 — 472
168
157 г 63
114
72
102
2 0 - 620
3 ДЦС 75 0,5 10,0 400
4 ДДС (0,03) 70 2 0 25 0 716
5 ДДС 40 1, Π— 340
6 ДДС 80 1, Π— 607
7 ДДС 65 О, 5 — . 360
8 ЦПХ 70 2,0 — 342
0,005 3,0 - 307
+ Механическую прочность оценивают
3 ч инкубации при перемешивании при распадается)
- ДДС вЂ” додецилсульфат натрия, ЦПХ - цетилпиридинийхлорид.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить препарат внутриклеточной глюкозоизомеравы с активностьр в четыре раза больше, чем
Ф визуально по наличию или отсутствию мути, 70 C;twk механически прочный (без мути);
5 по известному способу, а также сократить количество легко вымываемых раст. воримых веществ микробной клетки в 7-8 раз.! б!
)25248
Продолжение табл.3
Получение гращщированного препарата имечания
Содержание ,СВ в грану
-;лак, Х ак
0,2
287
72 96
Влажные гранулы после дубления непрочны
147 120
0,4
383 82
11Х потери активности в раст° вор
15Х инактнвации пад действием высокой температуры обработки клеток
0,6 +++.212 35
До 8Х активности в растворе
Инактивация
Инактивация образующейся в результате 30 мии кипячения гранул препарата илй в результате
Ф+ механически прочный (слабая мутьQ;+ механически непрочный (до ЗОХ гранул
При получении препарата глюкозо,н.":.омеразы предлагаемым способом мо жет быть использована биомасса про-, дуцентов, обладающих более низким уровнем глюкозоизомеразной актйвностн чем это необходимо для получения ак1". тинного препарата, что позволяет, расширить ассортимент микрооргаыход по елъй акивнос.в оцен6X OT.
ГМА аббаИЗНЫВ етюй
Общий в процентах от активности исходных клеток
Общий выхо в lip тах исхо ного
1125248 l8 глвкозоизомеразы и глвкозо-фруктозных сиропов - полноценных заменителей свекловичного сахара из крахмалопродуктов.
17 низмов — продуцентов глюкозоизомеразы .
Предлагаемый способ позволяет организовать производство препарата
Составитель Е. Воробьева
Редактор Н. Джуган Техред С,Легеза
Корректор Н. Король
Заказ 8435/ t8 Тираж 521
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Рауаскап наб. ° д. 4/5
Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4