Способ получения ферментных мембран

Способ получения ферментных мембран

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

I. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ЖМБРАН, включающий связывание ферментов с нерастворимым пленочным носителем в присутствии глутарового альдегида, о т л и ч a ю щ и и с я тем, что, с целью повышения ферментативной активности и механической прочности мембраны, процесс связывания ведут в присутствии сьгоороточногр альбуминаf а в качестве носителя используют макропористую лавсановую или поликарбонатную мембрану. 2. Способ по п. 1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что исяользуют 3 макропористую мембрану с проницаемостью 4,7-11,4%, диаметром пор 0,051-0,18 мкм и толщиной 9, мкм.

,SU„, СОЮЗ СОВЕТСКИХ

««Л«

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДК4 М ИЗОБРЯТКНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ.СВИДЕТЕЛЬСТВУ

\ «

)f ««« « (21)3525275/38-13 (22) 29.10.82 (46) 23.11.84. Бюл. В 43 (72) 10.Ю.Кулис, В.-С.А. Лауринавичюс

И.В.Песлякене, В.В.Гурявичене, Ю.В.Чирков, В.Н.Кузнецов и Е.М.Файнгерш .(71) Институт биохимии АН Литовской CCP (53) 577j15(088.8) (56) 1. Braun G., Thomas D., at.al. дед method., йох binding enzyme що1есиles in to а m«ter-insoluble) шаЫс;

properties affer insolubilisation "

"Biochem. Bioeng", V . 15, 1973, р. 359-375.

2. Кулис Ю.IO. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов, Вильнюс, "Мокслас", 1981, с, 72.

3. Акулова В.Ф., Вайткявичюс Р.К. и другие. Кинетика и стабильность глюкозооксидазы из Реп1сх11ъиш lyitale. — Прикладная биохимия и микробиология, 1978, т. 14, выц. 3, с. 377, 4. Nell.Ь.О., Маlоу J.Т. Ampегоmetrio response enhance — ment of

the immobilized glucose oxidase

enzyme. electrode.-"Апа1.chem.", 1976, ч. 48, N 11, 1597. (бР С 12 N 11/08// G 01 N 27/40 (54) (57) 1.. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТHbK МЕМБРАН, включающий связывание ферментов с нерастворимым пленочным носителем в присутствии глутарового альдегида, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности и механической прочности мембраны, процесс связывания ведут в присутствии сывороточного альбумина, а в качестве носителя используют макропористую лавсановую или поликарбонатную мембрану.

2 ° Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что используют макропористую мембрану с проницаемостью 4 ° 7-11 4Х, диаметром пор

0,051-0,18 мкм и толщиной 9,5-10 мкм.

1125249

Изобретение относится к клинической биохимии, а именно к способам получения ферментных мембран, которые могут найти применение в измерительных приборах на основе ферментов (ферментных анализаторах)для определения физиологически важных соединений и ферментативной активности.

Наиболее близким к изобретению 10 является способ получения ферментных мембран путем связывания ферментов с нерастворимыми пленочными носителями ,(на основе целлюлозы, пирролидона и н др. полимеров)в присутствии 15 глутарового альдегида Ц .

Однако полученные таким образом ферментные мембраны обладают низкой механической прочностью и малой активностью. Это связано с тем, что целлюлозные, пирролидоновые и другие полимерные. носители не обладают макропорами, следовательно, непроницаемы для белковых молекул, которые лишь адсорбируются на поверхности пленки. Их количество мало, поэтому полученные мембраны не обладают высокой каталитической активностью. Кроме того, используемые пленочные материалы не обеспечивают механической прочности, поскольку они.набухают з воде.

Целью изобретения является повышение ферментативной активности и механической прочности ферментных мембран.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментных мембран, включающему связывание ферментов с нерастворимым плеиочным носителем в присутствии глутарового альдегида, процесс связывания ведут в присутствии сывороточного альбумина, а в качестве

М носителя используют макропористую

45 лавсановую или поликарбонатную мембрану;

Причем используют макропористую .мембрану с проницаемостью 4,7-11,4, диаметром пор 0,051-0,18 мкм и тол-. щиной 9 5-10 мкм.

Повьппение ферментативной активности и механической прочности, в первую очередь, обусловлено применением макропористых пленочных носителей, обеспечивающих проницаемость мембран 55 а также использованием сывороточного альбумина, способствующего связыванию фермента с носителем.

Оптимальные параметры используемых мембран обеспечивают необходимый комплекс свойств получаемого в результате изделия (см. табл. 1 и 2) . Увеличение проницаемости(проницаемость мембран, выражена в процентах, показывает соотношение площади пор к общей площади мембраны и, следовательно, зависит от количества и диаметра пор) приводит к увеличению активности однако при этом падает механическая прочность. Таким образом, указанные параметры мембран являются оптимальными.

Пример 1. !600 ед. глюкозооксидазы растворяют в 0,6 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 6,8, добавляют

0,4 мл 4,5 -ного сывороточного аль1бумина и 0,04 мл 25Х.-ного глутаровога альдегида. Смесь тщательно перемешивают и выливают на макропористую лавсановую или поликарбонатную мембрану 20У20 см(проницаемость 9,5Х, диаметр пор 0,12 мкм)и покрывают сверху гидратцеллюлоэной мембраной, толщиной 10 мкм. Мембрану помещают в холодильник в течение 24 ч. Разрезают на куски диаметром 2 см и накладывают на РФ электрод(с It электродом контактирует гидратцеллюлозная мембрана)для определения ферментативной активности. Толщина полученной мембраны 45 мкм.

Пример 2. Готовят смесь аналогично примеру 1 и наносят на лавсановую мембрану диаметром 6 мм, которая предварительно прикреплена к резиновому кольцу. Прикосновением микропипеткой наносят мкл смеси и накладывают гидратцеллюлозную мембрану толщиной 10 мкм. Оставляют в течение 2 ч при комнатной температуре, наливают на Р1 электрод и определяют ферментативную активность.

Пример 3. Мембрану готовят аналогично примеру 2, однако используют макропористую мембрану, толщина которой 9,5 мкм, проницаемость 11,,4Х и диаметр пор 0,18 мкм.

Hp и м е р 4. Мембрану готовят аналогично примеру 2, используя макропористую мембрану, толщина которой 10 мкм, проницаемость 4,7 u диаметр пор 0,051 мкм.

Пример 5, Мембрану готовят аналогично примеру 2, в качестве полупроницаемой мембраны применяют целлофановую толщиной 55 мкм.

1125249

15 в,(2) .

< ""мак

i ° — „й (e),, 50 — плотность тока ферментного электрода; где

Пример 6. Мембрану готовят аналогично примеру 2, в качестве полупроницаемой мембраны используют триацетатцеллюлозную мембрану, полученную путем выпивания 1 мл

1,5%-ного раствора триацетатцеллюлозы в стакан воды, диаметром 10 см толщина мембраны 2 мкм.

Пример 7. Готовят смесь по примеру 1 и в количестве 1 мкл ее lp наносят на лавсановую макропористую мембрану толщиной 10 мкм, проницае:мостью 9,5% и диаметром пор 0,12 мкм, которая прикреплена к резиновому кольцу, как в примере 2. Наносят ацетатцеллюлозную мембрану толщиной

10 мкм(ацетатцеллюлозную мембрану готовят путем обработки 10 мкм толщины гидратцеллюлозной мембраны (100 см )150 мл смеси абсолютного пиридина и уксусного ангидрида (1:1) при 50пС в течение 13 ч. Толщина мембраны 25 мкм.

Пример 8. Аналогично примеру 2, но в качестве полупроницаемой ! мембраны используют полипропилен толщиной 10 мкм.

II р и м е р 9,. Готовят смесь из

:5 мг глюкозооксидазы и,15 мг пер оксидазы по примеру l. Ферментную мембрану готовят по примеру 2

Ферментная активность глюкозооксидазной и глюкозооксидазной-пероксидазной мембран(глюкозооксидазная .активность определена на Р1 электро де при 0,6 В(1-7)или -0,6В(8) отн. И

Ag/AgC1 электрода в 0,1 M фосфатном буфере рН ?,2; ферментативная активность глюкозооксидазной-пероксидазной мембраны определена в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 в присутствии 1 MM 40. ферроцианида калия на стеклоуглеродном электроде при О В отн.Ag/AgCl электрод@) приведена в табл. 1, Ферментативную активность биокаталитических мембран рассчитывают на основе величины тока ферментных электродов по формуле, приведенной число переносимых электронов (2); — число Фарадея, — ферментативная активность, Alp g ед/си ; а — толщина ферментных мембран;

Яп — Концентрация субстрата (1 MM j;

К вЂ” константа Михаэлиса(для

% глюкозооксидазы 5,87 мИ (3 ); ,А — коэффициент, отражающий электрохимически активную площадь электрода (0,01),(4) .

Полученные по предлагаемому способу мембраны в 10 раз прочнее механически, причем значительно вьппе их ферментативная активность(расчитывается на основе величины тока фермент- ного электрода). Используются мембраны проницаемостью 4,7-11,4Х, диаметром пор 0,051-0,18 мкм. Увеличение проницаемости приводит к увеличению активности(примеры 2-4) . Однако нет необходимости и даже нецелесообразно выходить за верхний предел проницаемости, так как примеры 4, 1,2, 9 и 3 показывают, что с увеличением проницаемости(увеличением диаметра пор) уменьшается механическая проч-. ность (хотя и за пределами она была бы вьппе таковой ). Наименьшей механи. ческой прочностью обладает мембрана по примеру 3. Таким образом, приведенные параметры являются оптимальными, обеспечивающими и достаточно высокую активность и высокую механи,ческую прочность. б

Сравнительные свойства глюкозооксидазной(1) и биферментной глюкозооксидазной-пероксидазной(2)мембран> полученных по известному(целлюлозная

1мембрана толщиной 55 мкм) и по

:предлагаемому способам (проницаемость ,макропористой мембраны 9,5Х, диаметр Bop 0,12 мкм, толщина 10 мкм)приве дены в табл. 2.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в повышении ферментативной активности и механической прочности ферментных . мембран, которые могут быть применены в ферментных анализаторах.

1125249

:Таблица 1

Параметры макропористой мембраны

Проницае.- Диаметр мость,X пор,мкм

0,0045

О, 1-0,8

Известная 80

8,85

0 12

12,0

9,5

0,12 0,5

8,80

9,5

11,4!

0,5

7,50

0,18

4,5

9,10

4,7

0 051

8,82

9,5

0,12

0,6

8,75

0,12

-8,80

9,5

0,12

8,80

0 12

0,12

1 2

8,85

:ф

Уменьшение тока восстановления кислорода.

Таблица 2

Мембрана

Характеристика

Ток электрода, мкА/см 0,0045 мМ

II

О;0023

1,8

1,2

Ферментативная активность,ед/см

0,2.

317

176

Расход ферментов, . мг/см

0,05

0,05

Время переходного состояния(„ 1 с!

110

110

Мембрана по примеру Толщина мембраны мкм

0,05

0,05

Ток злектррда, мкА/см мМ

1,80

Механическая прочность на а разрыв, кг/мм

10-12

25-30

1125ЪФ9

Продолмение табл.2

Иембрайа

Характеристика

Стерилизуется окисью этилейФ

Не стерилизуется(инактивация) .

Стерилизуемость и

") Прочность на разрыв, кг/мм

0,1-0,8

О,!-0,8

8,8

Заказ 8435/18 Тираа 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент",- r. Ужгород, ул. Проекатная, 4

Составитель И.Привалова ,Редактор Н.Джуган Техред С.Легеза Корректор А.Обручар