Способ получения иммуносорбента

Способ получения иммуносорбента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА , включающий прибавление к нерастворимому носителю антисыворотки, инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, последующую инкубацию и отмывку продукта в физиологическом растворе, отличающи йс я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве нерастворимого носителя используют 4-6%-ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, исполь (Л зуют неиммунную сыворотку.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

INIMC

РЕСПУБЛИК

09) (И) g(g) > G 01 N 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОсудАРстВенный комитет сссР пО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

I(21) 3511848/28-13 (22) 16. 11. 82 (46) 23.11.84, Бюл. М 43 (72) Н.Н.Войтенок и А.Л.Журавков (71) Белорусский научно-исследовательский институт переливания крови (53) 577.15(088.8) (56) 1. Hjelm Н,, Hjelm К., Sjoguist J.

Protein A from Staphylococcus aureus:

its isolation by affinity chromatography and its use as an immuno sor"

bent for isolation А immunoglobulins:

FEBS Lett 1972, 28, N - 1, р. 73-76.

2. Immunol. Methods, 1976, 117 р. 37-48. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИИЧУНОСОРБЕНТА, включающий прибавление к нерастворимому носителю антисыворотки, инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, последующую инкубацию и отмывку продукта в физиологическом растворе, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса, в качестве нераст. воримого носителя используют 4-67.-ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные груп- > пы нерастворимого носителя, исполь- ® зуют неиммунную сыворотку.

1125549. Изобретение относится к биохимии и иммунологии, а именно к способам получения иммобилиэованных антител, используемых при афинном разделении белков, и касается получения иммуно- 5 сорбентов, применяемых в аналитических биохимических исследованиях и медицинской диагностике для выделения и количественного определения малых количеств белков, например иммуноглобулинов различных классон, синтезируемых в культуре лимфоцитов человека .

Известен способ получения иммуносорбента, основанный на иммобилиэа- f5 ции белка А, выделенного из золотистого стафилококка, на Сефарозе 4 В (1).

Однако способ сложен, так как включаея стадии выделения белка иэ микроорганизмов, активации сефарозы 20 бромцианом и иммобилизации белка.

Иетод многостадиен, а иммобилизованный белок А не используется непосред ственно для очистки антител.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения иммуносорбента, включающий прибавление к нерастворимому носителю (Сефароза 4 В, активированная бромцианом) антисыворотки, 24-часовую инкубацию нерастворимого носителя с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нераст. воримого носителя (1M глицина), последующую инкубацию в течение 4 ч и отмывку продукта в физиологическом растворе (2) .

Недостатками известного способа являются длительность (свыше 28 ч) и сложность, обусловленная многостадийностью процесса. Кроме того используемая в качестве носителя Сефароза 4В является дефицитным и дорогим соединением, а ее активация тре- 45 бует работы с крайне ядовитым соединением — бромцианом.

Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса получения иммуно сорбента.

Поставленная цель достигается тем, что с оглас но с пос обу получения имму. носорбента, включающему прибавление к нерастворимому носителю антисыворот ки, инкубацию нерастворимого носите- 55 ля с антисывороткой, введение агента, блокирующего свободные группы нераст" воримого носителя, последующую инкубацию и отмывку продукта в физиологическом растворе, в качестве нерастворимого носителя используют 4-6 -ную суспензию фиксированных формалином и убитых нагреванием микроорганизмов золотистого стафилококка, несущих на поверхности белок А, а в качестве агента, блокирующего свободные группы нерастворимого носителя, используют неиммунную сыворотку.

Сущность способа заключается в использовании в качестве нерастворимого носителя 4-6%-ной суспенэии убитых стафилококковых микроорганизмов, что позволяет значительно сократить длительность инкубаций как с антисывороткой (до 30 мин), так и с блокирующим агентом (тоже до 30 мин), поскольку реакции присоединения антител, содержащихся в антисыворотке, и блокирующих агентов (белков),содержащихся в неимунной сыворотке, носят не химический характер и протекают исключительно быстро. Эти реакции хорошо протекают при физиологических рН при комнатной температуре, т.е. осуществление технологического процесса. протекает в одном температурном режиме (20 С) и с использованием одного буферного раствора с рН 7„6. Упрощение способа связано также с исключением потребности в специальном оборудовании (холодильной камере, электрическом "встряхивателе и др.). Кроме того., стафилококковые микроорганизмы, применяемые в качестве исходного " ûðüÿ,,имеют низкую стоимость и способны без какихлибо дополнительных затрат сами быстро увеличивать свою массу. Необходимость активации нерастворимого носителя бромидом циана отпадает, так как антитела, содержащиеся в антисыворотке, прочно присоединяются к стафилококковым микроорганизмам спонтанно. (Пример 1. Получение иммуносорбента, Взвесь фиксированных формалином и убитых прогрев-нием микроорганизмов золотистого стафилококка Кован 1 готовят по методу Кесслера.

Микроорганизмы инкубируют в мясопептонном бульоне при 37 С в течение

24 ч при перемешивании с помощью магнитной мешалки. Образовавшуюся микробную массу отмывают два раза в физиологическом растворе, содержащем

0,02 И фосфатный буфер с рН 7,6 н

0,05 мертиолата, центрифугированием

1125549 при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге ЦЛС-3. Затем микроорга; низмы встряхивают 1,5 ч в указанном буферном растворе, содержащем 1,5Х формалина и после отмывки прогревают при 80 С в течение 5 мин. После дополнительной отмывки концентрацию микроорганизмов доводят до 5Х. Суспензия может храниться не менее

4 мес. в физиологическом растворе, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с рН 7,6 и 0,05Х мертиолата. В центрифужные пробирки, содержащие по

0,05 мл 5Х-ной суспензии фиксированных формалином и убитых прогреванием 15 микроорганизмов золотистого стафилококка Кован 1, прибавляют по 0,05 мп кроличьей антисыворотки против II -или

-цепной иммуноглобулинов человека, 0и инкубируют 30 мин при комнатной 20 (20 С) температуре. Затем в пробирки а прибавляют по 6 мл неиммунной сыво" ротки периферической крови кролика и инкубируют еще 30 мин при комнатной температуре, после чего микроор- 25 ганизмы три раза отмывают физиологическим раствором, содержащим 0,02 М фосфатный буфер с РН 7,6, центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин. 30

Эффективность полученных иммуносорбентов иллюстрируется следующими примерами.

Пример 2. Получение иммуносорбентов проводят по примеРу 1, но 35 используют 1, 4, 5 и 6Х-ные концентрации взвеси клеток. Иммуносорбенты с концентрацией взвеси 4, 5 и 6Х сор. бируют иммуноглобулины G и М с нрак". тически одинаковой эффективностью 40 (специфичность иммуносорбента зависит от типа используемых для его получения антител). Эффективность сорбции для иммуносорбента, полученного на основе 1Х-ной взвеси клеток, сни- 45 жается в отношении иммуноглобулинов

С и М соответственно в 5-6 и 8-8,5 раз. Таким образом, эффективность последнего сорбента невысока. Использование концентрации взвеси вьппе 6Х нецелесообразно из-sa перерасхода исходного материала.

Пример 3. Определение содержания меченых углеродом-14 иммуногло. булинов G и иммуноглобулинов М в сме 55 си меченых белков.

Отмытые иммуносорбенты (0,05 мл) суспендируют в 1 мл исследуемого обВ

k- — ) А (2) где А — радиоактивность белков, присоединившихся к незаблокированному анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту;

Б — радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновому нммуносорбенту, блокированному

Нерадиоактивным иммуноглобулином соответствующего класса; разца, представляющего собой смесь меченых углеродом-14 белков с неиз" вестным содержанием радиоактивных иммуноглобулинов G и иммуноглобулинов М. Пробирки инкубируют 40 мин при комнатной температуре. Регистрируемой количественной характеристикой исследуемых иммуноглобулинов С и иммуноглобулинов M присоединяющихся в результате инкубации к иммуносорбентам, несущим антитела против -и 11-цепей иммуноглобулинов человека соответственнр, является величина их радиоактивности, прямо пропорциональная количеству иммуноглобулинов.

Специфичность анти-иммуноглобулиновых иммуносорбентов проверяют путем блокирования их присоединяющей способности нерадиоактивными стандартными иммуноглобулинами высокой чистоты. Для этого часть иммуносорбентов перед инкубацией с исследуемым образцом инкубируют 40 мин при комнатной температуре с избытком нерадиоактивного иммуноглобулина G (из расчета 25 мкг на 0,06 мл 5Х-ной взвеси иммуносорбента) или М (из расчета 100 мкг на 0,05 мл 5Х-ной взвеси иммуносорбента) и трижды отмывают.

Итоговую радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновым иммуносорбентам, определяют с помощью, бета-спектрометра после их отмывания в физиологическом Растворе, содержащем 0,02 М фосфатный буфер с

РН 7,6, и перенесения во флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость

Брэя. Степень специфичности присоединения иммуноглобулинов к анти-иммуноглобулиновым иммуносорбентам выражают коэффициентом (К) специфичности, который вычисляют согласно формулам

1125549

 — радиоактивность белков, присоединившихся к анти-иммуноглобулиновому иммуносорбенту, обработанному нерадиоактивным иммуноглобулином противоположного класса.

Наибольшей специфичностью обладак г анти-иммуноглобулиновые иммуносорбенты, характеризуемые коэффициентом

10 специфичности присоединения, равным 1

В таблице приведено определение . содержания меченных углеродом-14 иммуноглобулинов и иммуноглобулинов

М в смеси меченых белков. (B опытах

1 и 2 использовались два различных образца смеси меченых белков.

Как видно из таблицы, получаемые согласно предлагаемому способу иммуносорбенты, несущие антитела против -и 0 -цепей иммуноглобулинов человека, пригодны для высокоспецифичного определения содержания иммуноглобулинов G и иммуноглобулинов М в смеси

25 белков.

Итоговая радис>—

i активность белков, присоединившихся к имКоэффициент специИспользование (неиспользование) не1»адиоактпзного иммуноглобулина дпя блокирования иммуносорбентов с целью пров ерки их с пецифичности

Направленность иммуносорбента, используемого в,цанном варианте опыта

Вариант опыта фичности, К муносорбентам, имп./мин, М+и, п=3

9674+ 287

Не использовался

Анти-иммуноглобулин С

38464 130

Не использовался

Анти-иммуноглобулин М

Иммуноглобулин С

61+11

64+

Иммуноглобулин М

9753+ 86

5 Анти-иммуногло- Иммуноглобулин М булин G

3788+46

Иммуноглобулин С

Анти-иммуноглобулин М

3 Анти-иммуноглобулин G

4 Анти-иммуноглобулин М

Получаемые согласно предлагаемому способу иммуносорбенты пригодны для использования в качестве диагностического средства при оценке функционального состояния системы гуморального иммунитета у пациентов, в частности для определения гуморального иммунного отьета изучаемых лимфоцитов на митогенную стимуляцию.

Таким образом, использование изобретения позволяет значительно упростить (за счет уменьшения числа стадий и их сложности) и ускорить (сокращение времени процесса до 1-2 ч вместо 28 ч согласно известному способу) процесс получения иммуносорбента. При этом также происходит экономия малодоступного сырья и исключение из технологического процесса ядовитого реактива (бромциана). Указанные преимущества позволяют применять предлагаемый способ для рутинного изготовления иммуносорбентов в широком круге научно-исследовательских и медицинско-диагностических лабораторий.

1125549

Продолжение таблицы

Анти-иммуноглобулин С

Не использовался

12906> 49, 5769k 47

2 Анти-иммуноглобулин М

Ие испоользовался

821 1

Анти-иммуно глобулин G

Иммуноглобулин G

86» 3

Анти-иммуноглобулин М

Иммуноглобулин М

13735232

Анти-иммуноглобулин G

Иммуноглобулин М

5989 30

Иммуноглобулин G

Анти-иммуноглобулин М

Заказ 8532/33 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113053, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Ужгород, ул.Проектная, 4

Составитель В.Муронец

Редактор О.Бугир Техред Т.Маточка Корректор О.Луговая