Способ получения аденозин-5-монофосфата,меченного фосфором- 32

Способ получения аденозин-5-монофосфата,меченного фосфором- 32

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕН031Щг -5 -МОНОФОСФАТА, МЕЧЕННОГО ФОСФОРОМ 32 , путем облучения нейтронами на полоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2 ,3-0-анизилиденаденозин , четыреххлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединения - источника фосфора-Э2 и органический растворитель, с последуюпщм удалением защитных групп гидролизом , отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве органического растворителя используют Ы,К-диметилформамид или димет тилсульфоксид в концентрации 0,20 ,5 мол.% и процесс проводят в присутствии конденсирующего агента трихлорацетонитрвла в концентрации 0,,0 мол.%. к -ч| 00 00 00

СОЮЗ GOBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЭОБРЕТЕНИ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

f10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) .3547453/ 23-04 . (22) 23.12,82 (46) 07,12.84 Бюл. У. 45 (72) В.М.Крохалев, А.М.Макаров и А.С.Родыгин (71) Пермский ордена Трудового Kpac-, l ного Знамени государственный университет им. А.M.Ãoðüêoão (53) 547.963.6(088.8) (56) 1. Ленинджер А. Биохимия, N.

"Мир", 1976, с. 326-328 °

2. Введение в прикладную энзимолонию, Под ред. Березина И.В. и Мартинена К. Изд. Московского университета, 1982, с. 248.

3. Mehrli M.Å., Verheyden D.L.М., Noffatt Е.G. Dismutation Reactions

of Nucleoside Polyphoshates II. — .

"I.Amer. Chem. Soc", 1965, 87, У 10, 2265-2277.

4. Symons R.Н. Improved syntheзы of p-labelled 3,5 -сус1хс ANR

3,5 -cyclic GNR and other 3,5 cyclic ribo - and В.В.А 320, 1973, 535-539.

5 ° Авторское свидетельство СССР

В 1044016, кл. С 07 Н 19/20, 1981 °

6. Хроматография на бумаге, Под ред. Хайса И.М. и Мацека К. М., ИЛ, 1962, с. 509-. 511.

„„SU„„1127888 зд) С 07 Н 19/20 С 07 Н 19/02 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АДЕНОЗЦЦ-5 -МОНОФОСФАТА, МЕЧЕННОГО ФОСФОРОМ-32; путем облучения нейтронами на полоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей 2,3. -0-анизи- лиденаденозин, четыреххлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединения — источника фосфора-32 и органический растворитель, с последующим удалением защитных групп mpролизом, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, в качестве органического растворителя используют N,М-днметилформамид или диме-, тилсульфоксид в концентрации 0,2- 3

0,5 мол.X и процесс проводят в присутствии конденсирующего агентатрихлорацетонитрила в концентрации

0,5-1,0 мол.X.

f 1127 я

Изобретение относится к получению аденозин-5 -монофосфатов, конкретI но к усовершенствованному способу получения аденозин-5 -монофосфата

t меченного фосфором-32 (5 -" P- ЩФ) общей формулы

NHg

НО р QCHZ I

ОН

ОЦ OH

Применение нуклеотидов, меченных фосфором-32(» Р), является весьма . значительным во многих исследованиях.

В частности; аденозин-5 -монофосI форная кислота (5 -АМФ) с меткой P используется для изучения строения и метаболизма нуклеиновых кислот и их компонентов (1), а также является исходным продуктом для син- 1

5 теза 5 fd-" Р )-аденозинтрифосфата(2 1.

Известные способы получения меченной P аденозин-5-монофосфорной кислоты (5 — Р-АИФ) подразделяются

r 3 на ферментативные и химические (3 1 и (41.

Однако получение 5 - Р АМФ химическими способами продолжительно во времени, требует сложного аппаратурного. оформления и не позволяет получать высоких,молярных активностей.

Энзиматические методы получения 92

5- P АИФ дают хорошие р езультаты, но для проведения этого синтеза необходимо первоначально синтезировать Р АТФ и перед,.использованием под40 вергнуть его очистке. Кроме того, сам процесс получения целевого про дукта связан со сложными манипуляциями с радиоактивными веществами

45 продолжителен во времени и требует наличия аденозинкиназы. Недостатком его является также необходимость использования большого числа (более

10) труднодоступных ферментов и необходимость контролировать полноту превращения радиоактивного субстрата после каждой из стадий введения соответствующего фермента, что требует сложной и дррогостоящей аппара-, туры. Для энзиматических, как и для химических-способов синтеза 5 - P

1 %2 . АИФ также требуется предварительно получать меченные P соединения.

888

Наиболее-близким к изобретению.по технической сущности является споI соб, заключающийся в облучении быстрыми нейтронами íà Po-Be источнике системы четыреххлористый углерод

2,3-0-анизилиденаденозин-пиридин, при .этом атомы фосфора-32, образо" вавшиеся bio ядерной реакции С1 (ь,о1 ) P стабилизируются в форме аденозин-5 -монофоеФата. Ядерная ре- акция С1 (n,d ) 32P протекает при облучении быстрыми нейтронами любых хлорсодержащих соединений и имвет следующие преимущества: протекает с изменением порядкового номера элемента, вследствие чего радиоактивный з Р образуется в состоянии без носителя, т.е. без разбавления нерадиоактивными изотоном "P, что позволяет получать меченные препараты с удельной активностью, близкой к предельно возможной; наличие

; атомов хлора в системе способствует протеканию химических реакций, необходимых для Получения целевого продукта.

Атомы 3 P s момент образования имеют кинетическую энергию порядка

50 кэВ за счет отдачи при испускании

Ы вЂ .частицы, вследствие чего они об-. ладают повышенной реакционной способностью и в процессе столкновений с молекулами СС14 в основном ,отрывают атомы хлора, образуя хлориды эг

2P+ pe Р 4 з2рс<

РСРЗ рИ4 4 рС95

ССР4 32 cCt4 з2

При наличии в системе растворенного кислорода возможно образование хлорокиси фосфора 2РСРЗ +1/2Π— 32 POCt

3: 2 2

Образующиеся хлориды фосфора фосфорилируют 2,3 -О-анизнлиденаденоt I зин. После облучения системы (мишени) нейтронами защитные группы удаляют гидролизом и выделяют целевой продукт с помощью бумажной хроматографии.

Преимуществами известного способа являются совмещение в одну стадию ядерной реакции получения радиоактивного изотопа Р и необходимых превращений, ведущих к образованию целевого продукта, получение Р в состоянии без носителя, что позволяет достичь предельно возможной

Величины

Bg(х100) 5

Анализируемые вещества

1 2 3 4

5 -АМФ

31 21 80 43

46 31 64 25.

ÍЭРО+

Э Э

66 47 69 32

18 6 62 16 (лн+)Р О

С ЭCPOçHH

CL3CP (0) (0H) С1

68 49 54 49

89 95 98 60 з 112 активности меченных препаратов, существенное упрощение аппаратурного оформления и сокращение времени син теза целевого продукта (51.

Однако радиохимический выход

5- P-АМФ по известному способу нез2 достаточно высок (22-23X) и трудно воспроизводим из-за сильной зависимости результатов от степени осушки всех используемых в системе ком10 понентов.

Целью изобретения является новышение выхода аденозин-5 -монофосфата,. меченного фосфором-32.

Поставленная цель достигается

15 тем, что согласно способу. получения аденозин-5 .-монофосфата меченного ( фосфором-32 путем облучения нейтронами на полоний-бериллиевом источнике нейтронов смеси, содержащей

2,3 -О-анизилиденадечозин, четырех(20 хлористый углерод в качестве хлорсодержащего соединения — источника фосфора-32 и .органический растворитель с последующим удалением защит25 ных групп гидролизом, s качестве органического растворителя используют

N,N-диметилформамид или днметилсульфоксид в концентрации 0,20,5 мол.X. и процесс проводят в присутствии конденсирующего агентатрихлорацетонитрила в концентрации.

0,5-1,0 мол.X °

Облучение проводят в течение, 24, 150 ч. Защитные группы удаляют гидролизом. Выход- целевого продукта, 35 увеличивается до 36-447 по сравнению с 22-23Х в известном способе.

Для выяснейия,.влияния добавок на распределение 52Р в неорганической и органической формах облучают системы 40 состава С СР— органический раство-, ритель и СС8+ ССРЭ CN — органический растворитель. Полученные результаты приведены s табл.2 (мишень 1) .

Для анализа облученных мишеней и выделения 5- э2Р-АМФ используют бумажную хроматографию. Разделение проводят восходящим способом при комнатной температуРе на бумаге FN-12, используя следующие системы растворителей: ацетонитрил — муравьиная кислота-вода-аммиак(конц)в соотношении 18:3:6:0,2 (1); 1М СН СООННН, 3 Ф (рН 7,5) -, втанол в соотношении

3: 7 (2); изопропиловый спирт-водааммиак (конц) в соотношении 7:2:1(3); изомасляная кислота-вода-аммиак (конц) в соотношении 66:33:1 (4).

7888 4

Величины R(: свидетелей в указанных системах растворителей приведены в табл.1.

Таблица 1

Пятна свидетелей обнаруживают обработкой молибдатным раективом(6 ), а нуклеотиды кроме того по поглощению в УФ-свете. Радиоактивные соединения фосфора обнаруживают с по( (мощью радйоавтографии на рентгеновской пленке РМ-1 и на установке автоматического радиометрирования радиоактивных хроматограмм с использованием счетчика р-излучения СБТ-13 с коллиматором шириной ) мм. Сигнал со счетчика подают на интенсиметрПИ-4 и записывают на потенциометре

ЭПП-09. Скорость протягивания хроматограмм составляет 180 мм/ч.

Использовавшийся для облучения

СО марки "ОСЧ" дополнительно пропускают через бкись алюминия высшей степени активности и перегоняют. предохраняя от влаги воздуха. Органические растворители (N,N-диметилформамид и диметилсульфоксид), а также трихлорацетонитрил перегоняют над гидратом кальция и хранят над молекулярным ситом 4 А

Облучение проводят при комнатной температуре (15-25 С) в стеклянных колбах на 250 мл, в центре которых с помощью пробирки на шлифе помещают Ро-Be источник нейтронов интенсивностью около 10 нейтр/с или на генераторе нейтронов НГИ-5 мощностью около 105 нейтр/с. Время облучения 1-6 сут. После облучения к мишени добавляют 10 мл дистиллиЭ 1127888

4 рованной воды, тщательно перемеши- м вают и отгоняют основную массу ми- т

I шени в вакууме водоструйного насоса. 5. атографируют в одной из систем расворителей. Зону, соответствующую

- Р-АМФ, элюируют водой и чистоту целевого. продукта проверяют

5 хроматографированием в другой системе растворителей. Данные анализа облученных мишеней приведены в табл табл.2.

Т а б л и ц а 2

АМФ, Ж

СС1 СН, г/моль

Номер ССФ4 мише- г/моль

Фосфор ная

Защитные группы аденозина астворитель, мл кислота, 7

Тип Количество,мг

2,88(0,02) 400(2,6) 85 15

400(2,6) 2,88

28 60 12

34 52 14

1,44

2,88

30 55 15

2,88

ДМФА (1) 44 40 16

2,88

41 - 45 15

2,88

2,88

10 400(2,6) -"- 4, 2,88

11 400(2,6) -"- 4 2,88 происходит значительное осмоленне, что затрудняет выделение конечных продуктов. Значительное повышение выхода целевого продукта дает добавка 1 мол.Ж трихлорацетонитрила.

2,3 -О-защищенные производные аденозина очень плохо растворимы в четыреххлористом углероде..В объеме мишени (250 мл CCt ) не растворяется полностью даже 4 мг 2",3 -О-анизилиденаденозина. Поэтому навеску производного аденозина предварительно растворяют в ДМФА или ДМ50 (около

1 мл) и в виде раствора вносят в миОблучение проводили на нейтрон- 45 ном генераторе. Фосфорнлирование в мишенях с добавкой пиридина дает неустойчивые и низкие результаты.

С целью повышения выхода Ð-5 -АМФ в систему вводят различные добавки: 50 триэтиламин, ДМФА, ДИЛО, трихлорацетонитрил в количествах не более

1 мол.Ж, чтобы свести до минимума их влияние на распределение фосфора-32 между органической и неорганической 55 формами. ДМФА и триэтиламин желаемо, ге эффекта не дают, кроме того, при добавлении триэтиламина в систему

Защитные группы аденозина уда,ляют нагреванием с 80Х-ной уксусной кислотой при 100 С, кислоту удаляют упариванием в вакууме и остаток хро400(2,6 Анизил. 4

400(2,6) -"- 4

400(2,6) »"- 4

400(2,6) Изопроп. 4

400(2,6) Анизил. 4

400(2, б) Изопроп. 4

400(2,6 Анизил. 4

ЛИФА(1) — 83 1 7

Пиридин(1) 17 68 15

ДМО (1) 43" 40 17

Пиридин 38 42 20

ДМФА(1) 36 48 16

1127888

Составитель 1.Гусарова

Техред Ж.Кастелевич

Редактор Н.Джуган

Корректор А.Ильин

Заказ 8870/18

Тираж 380 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-.35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент™, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 шень. Анализ мишени состава ССР4— !

2, 3 -0-анизилиденаденозин CCeä СКДИФА показал, что 40-447. образующегося по ядерной реакции ЭэС0 (п,8 ) P

Э2 ! э2 фосфора-32 выделяется в виде 5- г- 5

АИФ.

Для выяснения влияния добавок на распределение фосфора-32 между органической и неорганической формами стабилизации по сравнению с чистым

ССР4 проведено облучение и анализ систем состава: СС04 -СС1э СЙ; CC8+—

ДИФА; ССЕ, -ДИЭО, ССЕ, -ССЕ, СК-ДИФА, СС04-CCE CN gM50 при различных концентрациях добавок. Установлено, 15 что введение указанных веществ в количествах до 1 мол.Ж практически не влияет на распределение фосфора32 в системе.

Препарат 5- P-АИФ испытан на 20

32 устойчивость к ферменту, избирательно гидролизующему моноэфиры фосфорной кислоты (ФИЭ, КФ 3..1.3.1). Анализ полученных продуктов проводят методом тонкослойной хроматографии 25 на ПЭИ-целлюлозе с последующей радиоавтографией полученных продуктов.

Результаты испытаний подтвердили

Э2 структуру препаратов как 5 -Э2P-АИФ.

Пример . Смесь 400 г (2,6,моль) ССРь, 0,004 r (10 .моль)

2,3 -О-анизилиденаденозина, 2,88 г (О;02 моль) трихлорацетонитрила и

0,95 r (0,013 моль) N,N-диметилформамида облучают íà Po-Be источнике

5 нейтронов мощностью 5.10 нейтр/сек в течение 6 сут. После облучения основную массу мишени отгоняют под вакуумом водоструйного насоса при температуре не выше 40 С. Затем в колбу 4О добавляют 2 мл 80X-ной СН СООН и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение

15 мин. После этого удаляют кислоту под вакуумом водоструйного насоса .при температуре не вышее 40 С. Для вы-!.Я2 деления из остатка 5 - r-АИФ его наносят на бумажную хроматограмму (бумага FN-13) размером 20 350 мм.

На такую же хроматограмму наносят смесь соединений — свидетелей и обе хроматограммы одновременно элюируют в водной камере в системе растворителей ацетонитрил-муравьиная кислота-! вода- аммиак (конц.) в соотношении

18:3:6:0,2. После разделения положение свидетеля 5-АИФ определяют по поглощению в УФ-свете, а остальных соединений — с помощью молибдатного реактива. Путем сравнения определяют положения 5 — Р-АИФ на радиоактив32 ной хроматограмме, соответствующую

I зону элюируют дистиллированной водой. Получают меченный фосфором-32 аденозин-5 -монофосфат в состоянии без носителя с общей активностью около 10 ИБк.

Таким образом, по предлагаемому способу можно получать целевой продукт активностью вплоть до 10 ИБк путем облучения мишеней указанного состава на мощном источнике нейтро-. нов или нейтронном генераторе.

Эффективность предлагаемого способа по сравнению с известным заключается в увеличении радиохимического выхода целевого продукта до

36-44/ вместо 22-23Х по известному способу и существенном улучшении воспроизводимости получаемых результатов.