Способ определения активности гормонов задней доли гипофиза /вазопрессина и окситоцина/

Способ определения активности гормонов задней доли гипофиза /вазопрессина и окситоцина/

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГОРМОНОВ ЗАДНЕЙ ДОЛИ ГИПОФИЗА (ВАЗОПРЕССИНА И ОКСИТОЦИНА) путем внесения его в культуру лимфоцитов с последующим учетом количества измененных клеток, о т п к ч а ющ и и с я тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, используют культуру лимфоцитов, чувствительную к действию гормона, при этом в нее ВНОСИТэритроците кролика и 1. активность препарата определяют по степени увеличения количества розеткообразующих лимфоцитов. 2.Способ по п. , о т п и ч а ющ и и с я тем, что для.определения активности вазопрессина используют культуру лимфоцитов тимуса морской свинки. 3.Способ поп.1,отличаю щ и и с я тем, что для определения , .активности окситоцина используют куль уру лимфоцитов лимфатических узлов морской свинки.

и)=а

СОЮЗ GOHETCHHX

ОРЭВЛМО

PECfb%JlHK ав au

SU !

gag А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

Й АВтОРсиОмУ сю4ДечельстВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3578341/28-13 (22) 12.04.83 (46) 15.12.84. Бюл. У 46 (72) Е.А.Михайлова, А.П.Луда, Я.И.Коц, О.В.Бухарин и И.А.Волчек (71) Оренбургский государственный медицинский институт (53) 615.375(088. 8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

,В 757164, кл. А 61 К 35/55, 1980. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АКТИВНОСТИ ГОРМОНОВ ЗАДНЕЙ ДОЛИ ГИПОФИЗА (ВАЗОПРЕССИНА И ОКСИТОЦИНА) путем внесения его в культуру лимфоцитов с последующим учетом количества измененных клеток, о т л и ч а юшийся тем, что, с;.целью повышет ния чувствительности способа, используют культуру лимфоцитов, чувствительную к действию гормона, при этом в нее вносят;эритроцита кролика и . активность. препарата определяют по степени увеличения количества розеткообразующих лимфоцитов.

2. Способ по п. 1, отличаюшийся тем, что для определения активности вазопрессина используют культуру лимфоцитов тнмуса морской свинки, 3. Способ. по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что для определения активности окситоцина используют куль- ф туру лимфоцитов лимфатических узлов морской свинки.

1 1128915 2

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к способам определения биологической активности гормонов, и может быть использовано при стандартизации препаратов гормо5 .нов, извлекаемых из головного мозга млекопитающих или птиц.

Известен способ определения активности гормонов задней доли гипофиза (вазопрессина и окситоцина) 10 путем внесения его в культуру лимфоцитов с последующим учетом количества нэмененньм клеток Ц .

Однако этот способ обладает низкой чувствительностью. .15

Целью изобретения является повышение чувствитегьности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности гормонов задней доли . гнпофиза (вазопресснна и окситоцина) путем внесения его в культуру лнмфоцитов с последующим учетам .количества измененных клеток, используют культуру лимфоцитов .Чувстви тельную к действию гормона, при этом в нее вносят эритроциты кролика и .активность .препарата определяют по степени увеличения количества розеткообраэующих лимфоцитов. держащие 0,1.мл взвеси лимфоцитов

Для определения активности вазо.36 прессина используют культуру лимфоцитов тимуса морской свинки. Для определения активности окситоцина используют культуру лимфоцитов лимфатических узлов морской свинки. З5

Способ выполняется следующим образом.

Осуществление способа стало возиожным лишь после того, как, учитывая .ранее известный эффект влияния гор монов задней доли гипофиза на лимфоциты крови в реакции бластной трансфорйации, были проведены более широкие лабораторные исследования по влиянию гормонов окситоцина и вазо- 4 прессина на функциональную актив-, ность клеток различной локализации: тимоцитов, спленоцитов, лнмфоцитов крови, костного мозга, лимфатических узлов с учетом их дифференцировки на Т- и В-лимфоциты. ности, позволяет надежно и быстро дифференцировать Т- и В-лимфоциты.

В результате проведенных испытаний .была выявлена высокая чувствительность Т-лимфоцитов лимфоузла к окситоцину и Т-лимфоцитов тимуса к вазопресснну. При этом было установлено, что при помощи реакции розеткообразования удается обнаружить . изменение функциональной активности клеток при минимальной дозе гормонов, составляющих 5яО(0,0005 M. åä.)

Выявленные новые знания и были положены в основу способа стандартизации гормонов задней доли гипофиза по реакции роэеткообразовання. В качестве биологического объекта использовали культуру лимфоцитоI тнмуса и лимфатического узла морской свинки. При стандартизации окситоцнна использовали лнмфоцнты лимфатического узла, а ваэопрессина— лимфоциты тимуса (тимоциты).

Пример . Были проведены

20 лабораторные испытания способа стандартизации .гормонов задней доли гипофиза . — окситоцина н ваэопрессина. Ме тодика проведения реакций была следующей. В силиконовые пробирки, сов среде 199 (25 млн/мл), добавляли по О,1 мл 2,5Х-ной взвеси эрнтроцитов кролика в той же культуральной среде и соответствующий гормон в различных дозах так, чтобы концентрация его составляла 50m U, 5щЦ, 0,5 tnt. В контрольные пробы вносили образцы тех же взвесей лимфоцитов и эрнтроцитов по 0,1 мл и растворитель"плацебо™. Полученную смесь центрчТехнически решение поставленной .задачи осуществлялось с помощью реакции роэеткообразования (связыва- нйя лимфоцитов с гетерологическими эритроцитами),которая, ввиду простоты высокой чувствительности и специфнчфугировали при 1700 об/мнн в течение

5 мнн, осадок ресуспендировалн н в камере Горяева подсчитывали число РОК, В табл. 1 показано влияние окситоцина на количество розеткообразующнх клеток лнмфоузла морской свинки.

В табл. 2 показано влияние вазопрессина на количество розеткообразующих клеток тимуса морской свинки.

Как видно из таблиц, концентрации гормонов равные и больше 5 щО вызывают стабильное увеличение числа РОК по сравнению с контролем, что позволяет рекомендовать дозу 5 ац в качестве минимальной для эталонных образцов при стандартизации гормонов.

Сравним степень чувствительности реакции розеткообразоваиия, используемой в предлагаемом способе, и

3 11 реакции бласттрансформации, используемой в прототипе, с помощью показателя удельного отклонения A равного где о — относит льное отклонение, Ж, Э вЂ” доза гормона, HALI

М,Мд — среднее контрольное и.опытное значение параметра реакции, соответственно (т.е. среднее количество измененных клеток, приходящееся на каждое 100 сосчитанных клеток), 7;

h9 — абсолютное отклонение.

Этот показатель — 4, представляет собой отклонение (изменение) функциональной активности клеток, вызываемое единицей дозы препарата, и позволяет судить о степени влияния гор-, мона на различные клетки.

В табл. 3 показано изменение функциональной активности клеток под действием минимальных эффективных доэ окситоцина и вазопрессина в реакциях г роэеткообразования и бласттрансформации.

Из табл. 3 видно, что реактивность клеток, используемых в реакции розеткообразования, на . действие испытуемых гормонов значительно превосходит таковую в реакции бласттрансформации (А ) А ), благодаря чему реакция роэеткообраэования является более чувствительной к действию данных гормонов и позволяет обнаружить действие меньших доз (Дщ,„= 5тЮ нежели реакция бластной трансформации (д = 100ftlU ) a таким образом, и предлагаемом способе по сравнению с прототипом

28915 4 для стандартизации гормонов задней доли гнпофиза — окситоцина и ваэопрессина, вместо менее чувствительной и более сложной реакции бластной

5 трансмиссии экспериментально подобрана более чувствительная и простая реакция розеткообразования. Вместо определения функциональной активности лимфоцнтов крови человека.под действием гормонов по прототипу, в предлагаемом способе. исследуются более чувствительные и просто получаемые лимфоциты тимуса и лимфоузла морской свинки.

Порог чувствительности клеток к действию гормонов по прототипу .составляет 0,1 М. ед. (100еО ), а в предлагаемом способе — 0,005 М.ед. (5 0 ), что свидетельствует о значительно большей чувствительности данного способа.по сравнению с известным и создает определенное его преимущвство.

Предлагаемый способ в отличие от

25 прототипа более прост, не требует стерильности проведения реакции, процесс получения чистой суспензии лимфоцитов,за счет их высокой концентрации .в данных органах значительно проще и легче процесса получения лимфоцитарной суспензин крови.

Предлагаемый способ стандартизации требует в 75 раз меньше времени для его осуществления, чем прототип.

Кроме того, предлагаемый способ не требует дорогостоящих и дефицит.ных материалов для его осуществления, таких,как: фиколл, глутамин, верографин, фитогемагглютинин, антибиотики - пенициллин и стрептомицин, 40 кровь человека, что также положи« ельно характеризует данный способ.

На основании:выше перечисленного можно рекомендовать дачный способ стандартизации гормонов задней доли гипофиза — окситоцина и вазопрессина. с

1128915

Таблица 1

Концентрация окситоцина, вЦ

Проба

50 .

0 5

Количество розеткоо

Контроль Опыт

8 6

8 15

25

21

12

10

20

7,33 16 33

8,16

7,1Б

9,50 25,00

Проба .

Таблица 2

Концентрация вазопрессина, ц

0,5

38

47

23

56

48

12

23

18

20

15

25

36

37

20,00

24,16 39,16

21,50 44,33

19,16

Среднее число .

P0K X

Среднее число

РОК, Х бразующих клеток (РОК), Х

Контроль Опыт Контроль Опыт

Качество роэеткообраэующих клеток (POK), Ж

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

1128915

Таблица 3

5mU

Вазопрессин

Окситоцин. Среднее значение параметра реакции, М контроль м„ опыт Мо контроль м„ опыт

Мо

t 6,33

39,,1 6

24, 16

7,33

Абсолютное отклонение (N M„) 9,00

15, 00

Относительное отклонение

8 = — 100% . ам

Мк

62,0

122,7.24,24

12,40

Продолжение табл. 3 IOO mU

Среднее значение параметра реакции, M

Вазопрессин

Окситоцин контроль

Мк контроль м„ опыт

N0 опыт

Мо

39,6

81,4

52,4

57,5

Абсолютное отклонение

aN - (Мо- И„) 29,0

17,9

Относительное .отклонение

31,1

35,6

0,356

0,311

BHHHHH Заказ 9268/4 .Ти аж 687 По сире

Филиал ШШ еит, г.Ужгород, ул.Проектная, 4, Удельное отклонение

Ь . А=, 7 щЦ

8- — . 1ООХ ам мк

Удельное отклонение

А р Х/аЦ

Реакция розеткообразования

Реакция бласттрансформации