Реагент для идентификации вибрионов

Реагент для идентификации вибрионов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

РЕАГЕНТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИБРИОНОВ, состоявший из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора, отличающийся тем, что, с целью упрощения количественного определения холерных вибрионов, в качестве носителя используют хроматографическую бумагу, которую пропитьшают средой, содержащей сахарозу, желатину и индикатор , взятых в соотношении 8-10Z, 1-1,5% и 88,5-91%, при этом в качестве индикатора используют диагностическую сыворотку О, Огава, или Инаба, ипи дагагностический холерный фаг С или Эль Тор.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

И »

РЕСПУБЛИК

3(59 С !2 Й 1 04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3480625/28-13 (22) 05 ° 08.82 (46) 15.12.84. Бюл. Ф 46 (72) В.М.Лавровская, А.И.Гуртовник и Н.Н.Носов (71) Горьковский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (53) 616 ° 932(088.8) (56) 1. Системы индикаторные бумажные для идентификации вибрионов.

ТУ 4214-123-78 (прототнп). (54)(57) РЕАГЕНТ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ

ВИБРИОНОВ, состоящий из высушенного

„.SUÄÄ 1129235 А

Фбумажного носителя, пропитанного смесью пленкообразующего стабилизатора и индикатора, о т л и ч а ющ и и .с я тем, что, с целью упрощения количественного определения холерных вибрионов, в качестве носителя используют хроматографическую бумагу, которую пропитывают средой, содержашей caxaposy, желатину и индикатор, взятых в соотношении 8-10Х, . 1-1,5Х и 88,5-91Х, при этом в качестве индикатора используют диагностическую сыворотку "0", "Огава", или

"Инаба", или диагностический холерный фаг "С" или "Эль Тор". количестве 1,3 мл каждого разведения на лист. Количество вносимых в бумагу сывороток рассчитывают с учетом получения титров антител, 5 участвующих в реакции агглютинации (в соответствии с рекомендациями .инструкции). Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором— пленкообразующнм полимерным покрытием — 1 поливиннловым спиртом в количестве 0,7 мл и спустя 20 мин помещают в морозильный шкаф при -40 С на сутки. Лиофилизацию проводят на протяжении 24 ч при остаточном давлении 100 мкм. Температура конденсатора -40 С. Начиная с четвертого часа для идентификации процесса вводят дополнительный подогрев до температуры в камере 31 С. Повьппение температуры не должно превьппать 4 в час. После лиофилизации бумагу нарезают в виде дисков диаметром 1 см.

Полученные указанным способом диски с холерными агглютинирующими сыворотками используют для постановки количественной реакции методом агглютинации.

В ряд стерильных пробирок фломбированным пинцетом помещают по одно30 му диску, содержащему по 0,02 мл сыворотки соответствующего разведе.ния (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.). В пробирки с дисками заливают по 0,5 мл стерильного физиологического раство,ра (рН 7,2) таким образом, чтобы они были полностью погружены в жидкость. Пробирки выдерживают 30 мин .в термостате для наиболее полного элюирования антител в физиологический раствор. Таким обраэом,в элюирую-, 40 щем растворе сыворотки разводят в

25 раз (1:50, 1:100, 1:200 и т.д.).

Затем во все пробирки вносят по

0,5 мл одномиллиардной взвеси смыва суточной агаровой культуры исследуемых штаммов (используют два музейных штамма холерных вибрионов Ч. cholerae й"* 145, серотип "Инаба" и V. cholerae

N- 1409, серотип "Огава"), т.е. сыворотки разводят еще в 2 раза, получая конечные разведения 1:100, 1:200, 1:400 и т.д., до титра сывороток.

Пробирки встряхивают, ставят на 2 ч в термостат при 37 С и затем предва- рительно учитывают реакцию. Оконча55 тельный учет производят через 18 ч выдерживания пробирок при комнатной температуре по четырехкрестовой системе.

1 1129235

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для лабораторной диагностики холеры.

Известен реагент для идентификации вибрионов, состоящий из высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообраэующего стабилизатора и индикатора Г13.

Однако известный реагент позволяет провести только качественный анализ и усложняет его проведение.

Цель изобретения — упрощение количественного определения холерных вибрионов.

Указанная цель достигается тем, что в реагенте для идентификации вибрионов, состоящем иэ высушенного бумажного носителя, пропитанного смесью пленкообраэующего стабилизатора и индикатора, в качестве носителя используют хроматографическую бумагу, которую пропигывают средой, содержащей сахарозу, желатину и индикатор, взятых в соотношении 8-10Х, 1-1,5 и 88,5-91, при этом в качестве индикатора используют. диагностическую сыворотку "0", "Огава" .или "Инаба", или диагностический холерный фаг "С" или "Эль Тор".

Реагент приготовляется следующим образ<м.

Хроматографическую бумагу предва= рительно обрабатывают сахароза-желатинозной средой (8-10%.и 1-1,5 соответственно). Растворы диагностических сывороток (в физиологическом растворе рН 7,2-7,4) и фагов (в защитной сахарозо-желатинозной среде) готовят с учетом получения конечных разведений при постановке реакций агглютинации и фаголизиса в титровании, Высушивание систем проводят лиофильно.

Пример 1. Для приготовления систем диагностических серологических в качестве носителя используют стерильную хроматографическую бумагу 5 х 10 см2, предварительно обработанную сахарозо-желатинозной средой (10X и 1Х соответственно), в количестве 1 мл и подсушенную при

37+1 С в течение 40 мин. Подготовленные листы бумаги указанного размера пропитывают в кюветах двухкратньпчи разведениями (1:2, 1:4, 1 .8, 1: 16 и т.д.) специфических холерных сывороток "0", "Инаба", "Огава" в физиологическом растворе рН 7,2 в

Таблица 1

Способ приготовления

Белок, мг/мл, в исходном раз ведении сыворотки (! 100) Срок хранения

Специфическая активность сывороток (рабочий титр) дисков

Прототип+

До 8 мес

0,6

1: 1800

1:3600

Предлагаемый

2 года в разведениях до ра-. бочего титра (срок наблюде.ния) 1,0 кСушка при +80 g приводит к разрушению иммуноглобулина (антитела) .

Данные приведены при сушке 37 С.

3 1

Результаты постановки реакции агглютинации с помощью бумажных, тестсистем серологических и классическим методом идентичны: через 2 ч наступает четкая на 3-4 креста агглютинация Vibrio cholerae ¹ 145 с сыворотками "О" и ".Инаба" до их титра, а

Vibrio cholerae ¹- 1409 — с сыворот"011 и0 и °

Результаты количественного определения антител по белку (методом

Лоури) представлены в табл. 1.

Пример 2. Для приготовления систем диагностических фаговых стерильную хроматографическую бумагу

5 х 10 см обрабатывают сахарозо-желатинозной средой (10% и 1,5% соответственно) в количестве 1 мл, затем подсушивают в течение 40 мин при

37+1 С. Подготовленные листы бумаги пропитывают холерными диагностичес- . кими монофагами "С" (классическим) и "Эль Тор" в объеме 1,2 мл, используя цельные и десятикратные (10 ", 10 2, 10 до рабочего титра фага) разведения в сахарозо-желатинозной среде (10% и 1,5% соответственно), В две чашки Петри разливают по

18-20 мл питательного щелочного агара рН 7,6. После застывания и подсушивания агара в течение 30 мин при

37+1 С дно чашек расчерчивают на квадраты по количеству используемых разведений диагностических фагов.

На каждую из чашек наносят слой

0,6% расплавленного и остуженного

129235 4

Через 20 мин листы бумаги покрывают стабилизатором — пленкообразующим полимерным покрытием — 1% поливиниловым спиртом в количестве 0,7 мп и спустя 20 мин помещают в морозильный шкаф при -40 С на сутки. Лиофилизацию проводят на протяжении 24 ч .при остаточном давлении 100-200 мкм.

Температура конденсатора -40, начи1р ная с четвертого часа для интенсификации процесса вводят дополнительный подогрев до температуры в камере ,31 С. Повышение температуры не должо но превышать 4 в час. После лиофичизации бумагу нарезают в виде дисков диаметром 1 см.

Диски с холерными Лагами используют при определении фагочувствительности двух музейных штаммов холерных вибрионов (Vibrio cho?erae № 1409 и Vibrio cholerae ¹ 888) °

Сравнительная характеристика серологических (холерных "0")диагностических тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены в табл. 1.

50 питательного агара рН 7,6 (5 мл), содержащего О, 2 мл взвеси смыва суточной агаровой или двухчасовой бульонной исследуемой культуры. 3атем в каждую чашку на поверхность

55 агара помещают диски, содержащие холерные фаги "С" (классический) и

"Эль Тор" в разведениях. После подсушивания с приоткрытыми крышками

1129235

Таблица 2

Способ приготовления дисков

Активность фага (рабочий титр) Срок хранения

О, 2.10

О,Я ° 10

Прототип +

10 -2

3 мес

1,5 года в рабочих разведениях (срок наблюдения) Предлагаемый

Сушка при +80 С приводит к гибели фаговых частиц.

Данные приведены при сушке 37 С. при комнатной температуре в течение

30 мин чашки инкубируют в термоста те при 37+1 С.

Предварительный учет результатов реакции проводят через 4 ч, окончательный через 18 ч. Наличие ореола лизиса вокруг диска при четком выявлении газона культуры на чашке оценивают как положительный результат. Четкий лиэис Ч. cholerae Ф 888 наблюдают через 4 ч иикубирования в термостате, а лизис Ч. cholerae

Среда для сохранения и выхо« да специфических антител и кор пускул фагов подобрана в опытах с применением различных конЦентраций сахарозы и желатина, растворенных в дистиллированной

Воде °

Ф 1409 через 18 ч. Результаты идентичны результатам при постановке реакции классическим методом и с помощью систем диагностических Aaro5 вых, Количество живых фаговых частиц в дисках проверяют методом Грациа (табл. 2).

Сравнительная характеристика фаговых холерных "Зль Тор" диагностических тест-систем в дисках, приготовленных по прототипу и предлагаемому способу приведены .в табл. 2.

Количество корпускул фага, выявляемых методом

Грациа (из разведения

10-2 ) Оптимальные результаты по всем использованным диагностическим препаратам получены со средой, содержа4 щей 8-.107 сахарозыи 1,0-1,5Х желатина.

В табл. 3 приведены средние данные из 10 опытов достигаемого эффекта по отношению к прототипу.

1129235

Х

О са

Р Р

u,Х

Id

ЕЕ

Е»

О

О х

I0

Х

Е

Ф3

Е»

О

О

Х

6)

Ф

О .0

Е» ъ(с

А

О

О

С О

О О О

О О г

Р 10 Х с0 Х.0 Х Э Э

Х Е Х

О О

С О

О О

С

О

Ю

О

О О О О

О О О О

О

О

О

О О

О О

О

ad IO & О

1 сс! 1

Р, dl

Х Х

И

О

I

Х

Э

1-.1

° е

Сс1

Х

О

С;

Э

CA л л

СЧ С׻— сГ\ л

an

1 л

СЧ л

СЧ

Х

Х

Е

I с0 л

СЧ °

М

О

Э с6

I0

О Э

1 Р

Р, Е

О

О

СЧ

С«1

О О О О б сР О О

О - Р Р

С«) СЧ

О

О

С 1

О 5

О О сР СО

СЧ

cd p, !

С Р, Осо д Х

О Х

О

l0

О О

О 00

СЧ 00

С 1 С»4

1 с0

О

О ХР.g

С= I0

00 л

«Ь

О л

01 сО 00 с л л л

00 l О

00 CO

СО л

00

СО CO л л

01 Ch сС с О л л

01 01

00 00 л

СЧ л

СЧ л л

I О

СЧ СЧ С 4

Д

О

Х

О

О щ 1«î

О

»» 01

lO

О

О

О

И

1

I 0C

О »Э I

Х 2 Х 3

Е» I» 3

О О О с0 О е 1: с Х

Э I

0(Р, Э

cd с,с!

О с0 О

И с Х ъ

Ю

О

О

О

И

1

О

Р 1»

И Х

Е

О О

Е»

ad

Е

О

О

ЕС ,О

О

Р

О

И

О

А

О

О

Х

I0

Х

Е»

Х с0

ЯФ

Х

Й

I

Е»

О

К с:

О

«4

1 !

С

И

Э

Х

О

ad

Р»

Р

О

О

I0

Х

Е» 4с

«О

1 Е»

Х О

Х л

О О

И сч N» »C с 4 с 4

СО»- СЧ СЧ CV»- » СЧ СЧ а ю сСа an л л л л — С»1 СЧ»- СЧ С \ С»с

О О О О О О О D О О О О

О О О О О О О О О О О О

СЧ» ) Л CO 00 С 4 Л ф ф Л

Ф

СЧ б сЧ СЧ СЧ СЧ

CO»- . С 4 СЧ СЧ - СО - СЧ СЧ сС с с л л л л

» СЧ »» °

Р Л СП СЧ 00 сР сР С4 С4 л л л л л л л л

О О О - - О О О

О

1 Э

lg ,Х

Х

dI Э

С4 Х ф

R Р, О ф Е»

Х Х

О Е dl

Р И

И cd Х

Э .dl

Х ж

Х Х

Х Х cd

И О Ф:Т

11с Эс М з1к Ф

9 ll29235 10

Предварительная пропитка хроматог- постановке реакций агглютинации и фарафической бумаги сахарозо-желатиноз- голизиса. Лиофильное высушивание и ной средой обеспечивает наиболее предварительная пропитка сахарозополный выход из диска специфических желатинозной средой предотвращает антител и фаговых корпускул. 5 гибель антител и фаговых корпускул 1 и позволяет сохранять эти системы

Различное соде а не в системах в течение 1 5 лет для фагов (срок

1й, Э антител и фаговьЫ" ас иц позволяет наблюдения) и 2 лет для сывороток проводить количественный анализ при (срок наблюдения1Составитель П.Бонарцев

Редактор О.Колесникова Техред С,Мигунова Корректор Л.Пилипенко

Заказ 9304/20 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4