Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ (его варианты)

Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ (его варианты)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Биоспецифический полимерНьй адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель. связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного -носителя, связанного с ингибитором , сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хпорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или N-винилпирролидона и бифункционального схци ающего агента , взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.%, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.%, вода - остальное. 2. Биоспецифйческий полимерный адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный С белковым ингибитором протеиназ, и воду, отличающийся тем, что, с целью повьшения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с СО ингибитором, сшитый сополимер ofib мукоида из белка утиных яиц, ацилиоо , рованного хлорангидридом ненасыщен00 00 ной кислоты, акриламида, или метакриламида , или N-виниапирролидона и бифункционального сшивающего агента , взятых соответственно в количествах; 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041 ,40 мае. %, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414 ,1 мае. %, вода остальное.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИН 4 (51

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3427499/28-13; 3427601/28-13 (22) 15.04.82 (46) 30.01.85. Бюл. ¹ 4 (72) Н.А.Платэ, Л.И.Валуев, И.А.Маклакова, В.В.Чупов, Т.А.Валуева, В.B.Мосолов, В.Г.Акопян, В.Т.Кондаков и В.В.Щербачев (71) МГУ им. М.В.Ломоносова, Институт биохимии им. A.Н.Баха и Центральный ордена Ленина институт усовершенствования врачей (53) 577.15(088;8) (56) 1. Liepnieks ?.J., Light А.

Preparation of P-Trypsin by А1:йinity Chromatography of Entегоkinose—

Activa .:4 Bovinå Trypsinigen.—

"Апа1усЬ aI Biochemistry" 1974, ч. 60, р. 395-404,.

2. GiIliam Е.В., Kitto G.Â.

Isolation of starfish trypsin by аЕКinity chromatography. — "Сошрагаtive Biochemistry and Physiology", 1976, v. 54, р. 21-26.

3. Иульгин N.H., Валуева Т.А., Кестере А.Я., Мосолов В.В. Свойства утиного овомукоида, очищенного методом афинной хроматографии на трипсич-сефарозе. — "Биохимия", т. 46, № 3, с. 473-480. ! (54) БИОСПЕЦИФИЧЕСКИИ ПОЛИМЕРНЫЙ

АДСОРБЕНТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ПРОТЕИНАЗ (КГО ВАРИАНТЫ) . (57) i. Биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, „.Я0„, 1137388 А связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью новышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного .носителя, связанного с ингибитором, сшитый сополимер овомукоиpà из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакрил-амида, или М-винилпирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80-90,60 и 8,60-15,60 мас.Х> при содержании указанного сополимера в адсорбенте ф

4,2-13,0 мас.Ж, вода — остайьное.

2. Биоспецифйческий полимерный

Ф адсорбент, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым инги битором протеиназ,. и воду, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения емкости адсорбента по протеиназам, он содержит в качестве полимерного носителя, связанного с ингнбитором, сшитый сополимер DA)мукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакриламнда, или К-виниднирролидона и бифункционального сшивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30, 55,20-90,55, 8,6041,40 иас. Ж, при содержании указанного сополимера в адсорбенте 3,414, 1 мас. Ж, вода — остальное.

1137388

Изобретение относится к химии полимеров и биохимии, а именно к биоспецифическому полимерному адсор-, бенту для выделения протеиназ из биологических жидкостей, и может быть использовано для получения высокоочищенных препаратов протеиназ, а также для очистки биологических жидкостей от этих ферментов. Последнее необходимо для предотвращения ферментативного разрушения белковых веществ в процессе их выделения из объектов животного происхождения.

Для выделения протеиназ из биологических жипкостей известны биоспе/ цифические адсорбенты, содержащие полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду и получаемые активацией полимерного носителя - 20 сшитого полисахарида (сефарозы) бромцианом с последующим ковалентным присоединением к активированной сефарозе белкового ингибитора протеиназ (1 ).

Для этого к набухшей в воде сефарозе, содержащей 4-6Х твердого . полимера, при рН 11,0 добавляют бромциан. Полученную суспензию перемешивают в течение 8 мин, поддержи- 30 вая рН равным 10,8-1 1,2 добавлением

5 М раствора гидроокиси натрия. 3атем активированную сефарозу промывают водой и бикарбонатным буфером (pH = 9,5), и к ней добавляют раствор ингибитора. Суспензию перемеши-. вают 18 ч при 4 С, многократно промывают буферными растворами с рН

2,2 и 8,0 и непрореагировавшие группы активированной сефарозы нейтрали- 40 зуют раствором глицина.

Известен биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ из биологических жидкостей, 45 содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.

В качестве полимерного носителя, концентрация Которого в адсорбенте 50 составляет 4 мас., адсорбент со;держит сшитый полисахарид сефарозу, а в качестве белкового ингибитора протеиназ — ингибитор трипсина из . сои. Концентрация ингибитора сос- 55 тавляет 25 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать трипсин в количестве 5 мг/мп адсорбента 23.

Недостатками этого адсор бе нта являются невысокая эффективность адсорбента, составляющая 0,2 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств адсорбента, который в качестве полимерного носителя содержит способный разрушаться под действием ферментов полисахарид — сефарозу, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Последнее не позволяет использовать адсорбент для извлечения протеиназ из крови. Кровь при контакте с таким адсорбентом свертывается в течение

5-6 мин.

Наиболее близким к изобретению является биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель с ковалентно иммобилизованным белковым ингибитором протеиназ и воду.

В качестве полимерного носителя, концентрация которого в адсорбенте составляет 4-6 мас.Х, адсорбент содержит сшитый полисахарид — сефарозу,а в качестве белкового ингибитора npof теиназ — ингибитор трипсина из лимской фасоли, Концентрация ингибитора составляет 5,4 мг/мл адсорбента. Адсорбент способен поглощать

1,6 мг трипсина/мл адсорбента (3 ).

Недостатками этого адсорбента являются невысокая эффективность адсорбента по протеиназам, составляющая 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, лабильность химических и биологических свойств ацсорбента, а также низкая гемосовместимость адсорбента. Время свертывания крови при контакте с таким адсорбентом составляет 5-6 мин.

Целью изобретения является повышение емкости адсорбента по протеиназам.

Поставленная цель достигается тем, что биоспецифический полимерный адсорбент для выделения протеиназ, содержащий полимерный носитель, связанный с белковым ингибитором протеиназ, и воду, в качестве колимерного носителя, связанного с ингибитором, содержит сшитый сополимер .овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида или метакриламида, или -винилпирроли3 1 дона и биофункционального смешивающего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-6,35, 77,80

90,60 и 8,60-15 60 мас. 7 при содержании указанного сополимера в адсорбенте 4,2-13,0 мас.Х, водаостальное.

137388 нице между исходной концентрацией этих веществ н их концентрацией в промывных водах. Содержание полимера в адсорбенте определяют высушиванием адсорбента в вакууме при ком натной температуре до постоянного

;веса.

Кроме того, в качестве полимерного носителя, связанного с ингибито- 1р ром, адсорбент содержит сшитый сополимер овомукоида из белка утиных яиц, ацилированного хлорангидридом ненасыщенной кислоты, акриламида, или метакрнламида, или И-винилпирролидона и бифункционального сшиваю- щего агента, взятых соответственно в количествах: 0,35-17,30i. 55,2090,55, 8,60-41,40 мас. 7 при содержании указанного сополимера в . адсорбенте 3,4-14, 1 мас.Ж, вода— остальное.

Используемый овомукоид является гликопротеином с мол. массой около

22000. Его выделяют из белка утиных яиц по методике (3 3. Гепарин является мукополисахаридом, который применяют для предотвращения свертывания крови.

Биоспецифический адсорбент получа-ЗО ют раздельным ацилированием овомукоида и гепарина хлорангидридом акриловой или метакриловой кислоты при рН 6,0-8.0, температуре 0-30 С и мольным отношении овомукоид (гепа- 35 рин):хлорангидрид равном 1:10-100.

Затем полученные растворы смешивают и к ним добавляют акриламид, иетакриламид или N-винилпирролидон в количестве 7-20 мас. Х, бифункцио- 40 нальный сшиванщий агент, например

N,N -метипенбисакриламид или диэфир метакриловой кислоты, в количестве

0,7-15 мас. Х и инициатор радикальной полимеризации. Полученный раст- 45 вор вакуумируют или продувают инертным газом для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием раствора при О20 С в течение 10-20 мин. Получен- 50

D ный продукт измельчают до частиц- с размерами О, 1-1,0 мм и промывают бикарбонатным буфером с рН 8,0 до полного удаления непрореагировавших соединений. Полноту удаления контро- 55 лируют спектрофотометрически..Количество связанного с полимером гепарина и овомукоида определяют по разЛля выделения протеиназ из биологических жидкостей адсорбент помещают в колонку объемом IO-50 мл, и через колонку пропускают жидкость. Количество адсорбированного фермента определяют по разнице между его исходной концентрацией в жидкости и конечной концентрацией или путем элюции адсорбированного фермента буферным раствором с рН 1,52,0. Промывание адсорбента указанным буфером обеспечивает полную элюцию фермента и многократное использование адсорбента. Гемосовместимость адсорбента оценивают по времени образования фибринового сгустка (тромбиновое время) при реакции фибриногена с тромбином в присутствии адсорбента или путем измерения времени свертывания крови при ее контакте. с адсорбентом.

Пример 1. В 80 мл бикароонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 100 мг овомукоида из белка утиных яиц. К раствору при 0 С добавляют 0,01 мл хлорангидрида акриловой кислоты, Реакционную смесь перемешивают при О С в течение 15 мин.

В 20 мп бикарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 20 мг гепарина, к раствору добавляют 0,003 мл хлорангидрида акриловой кислоты.

Раствор перемешивают при 4 С в течение 15 мин. Оба раствора смешивают и к ним добавляют 10 r акриламнда с

Э 1,0 г N,N -метиленбисакриламида и инициатор полимеризации — 0,01 r персульфата аммония и 0,2 мл

4X Horo pacTsopa N,N,N,N тетра метилэтилендиамина. Через раствор в течение 10 мин пропускают аргон для удаления растворенного кислорода. Полимеризацию проводят выдерживанием реакционной смеси при 10 С в течение 20 мин. После окончания полимериэации адсорбент, который представляет собой хорошо набухающий в воде полимерный гидрогель, измельчают и промывают бикарбонатным буфером до полного удаления непрореагировавших соединений.

1137388

Свойства адсорбента приведены в табл. 1. Аналогичным образом получают адсорбент без гепарина, Свойства этого адсорбента также приведены в таблице. 5

П р и м.е р ы 2-4. Процесс получения адссрбента проводят по примеру 1, используя различные мономеры и сшивающие агенты. Состав исходной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 1.

П р имер 5. В 10 мп бнкарбонатного буфера (рН = 8,0) растворяют 10 мг овомукоида из утиных яиц, К раствору при О С добавляют 15

0,001 мл хлорангидрида акриловой кислоты. Реакционную смесь перемешивают при 0 С 15 мин. Затем к полученному раствору добавляют 1,0 г акриламида, О, 1 г N,N — метиленбисак- 20 риламида и инициатор полимеризации—

0,01 г персульфата аммония и 0,1 мл

0,47-ного раствора N,N,N И -тетра( метиленэтилендиамина. Через раствор в течение 5 мин пропускают аргон. 2Б о

Полимеризацию проводят прн 15 С в течение 10 мин. После окончания полимеризации адсорбент измельчают и промывают бикарбонатным буфером (рН = 8,0). Свойства адсорбента при- 3О ведены в табл, 2.

Пример ы 6-10. Процесс получения адсорбента проводят по примеру 5, используя различные мономеры и сшивающие аге:--ты. Состав исход- З ной реакционной смеси и свойства адсорбентов приведены в табл. 2.

В табл. 1 и 2 приняты следующие обозначения: ХААК вЂ” овомукоид,ацилированный хлорангидридом акриловой кислоты, ХАКК вЂ” овомукоид, ацилированный хлорангидридом метакриловой кислоты, AA — акриламид, ВП вЂ” N-винилпирролидон, MAA — метакриламид, БИС вЂ” N,N — метиленбисакриламид, ТГИ-13 — диэфир метакриловой кислоты и полиэтиленгликоля со степенью полимеризации 13.

Таким образом, предлагаемый адсорбент обладает повышенной эффективностью. Так, емкость адсорбентапрототипа, который одновременно является базовым объектом, составляет 0,3 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора. Емкость адсорбента по изобретению составляет

0,8-1,0 мг трипсина на 1 мг иммобилизованного ингибитора, т.е. этот адсорбент является в 3-4 раза более эффективным, чем адсорбент-прототип.

Повышенная эффективность адсорбента позволяет в 3-4 раза сократить расход наиболее дорогостоящего компонента адсорбента — белкового ингибитора протеиназ. Использование в качестве полимерного носителя синтетического полимера карбоцепного строения на основе легко доступных мономеров, кроме того повышает устойчивость адсорбента к деградации под действием кислот, щелочей и различных ферментных систем по сравнению с адсорбентом-прототипом, который является полисахаридом и содержит в основной цепи легко гидролизуемые связи углерод-кислород. Состав адсорбента, а следовательно, и набухаемость адсорбента, можно легко регулировать путем изменения состава исходной реакционной смеси. Изобретение характеризуется также доступностью и простотой выделения овомукоида из белка утиных яиц.

1137388

Ю

<4 ь

+I

Ю +I

ОО

СЧ о

+ o

С 1

+I ь

С5, С»

o z о Г

1 о

1 х х о о, о

О 1х х х ю

<б Х 1

1»

Я х

1»

Х

0)

Я1 ,Я

Ю л 0 а)

E» E

v x о е х ю

& х

1 х (U ф.

Ю =К

СО С»! М л л л

СЧ М М ф 1»

Ю и л

С»! ф

М

СЧ л

О1 л о

Е» о о о, о

СО

М л х

I х

I а

Е х

Ю Ь л л 1

ОО со 1

».

1

1 о л

М л,о о

cd

)»»

А х

1 о

Р с о » х х х

1» о о

I х

И

Г

С; х

Х !»

О Е

I о

М л

С4 л

Ю л

Ю»

Ж М

EQ I

»

1 I

Ю = С С

» I с»1 (Э ж

1 14

С4 о х

E о ф

С л

С4

Ф

X о х о

С0

Ю ! С 1

Ю

Ю

Г».И. И

;3. Я о

Ф

Е о

C х

tf 1 о

Х 1

u -!

Ж I

Ю а О г lA

С 4 С 4

Ю Ь Ю СО CO л л л

»» о о

Ch л о С»! л СЧ л л л

Ю С Ю o o o о

Д»

Г4 <б о е о

I Х Ц

Х (U

1 о

1-ХО

I Ю I:4 са о х

С4 V о

mx9

I E» Kl m о о

1 3 Х 5

1 и Х Х

1 йВЬ р, д о. ооо

Zu™Qv ! Ф

1137388

10 о с

1 ф !

0 !» О оахх

Х 1- Х

Ю Х Ф cd cd х Ф е» ю

I-ЮХО8

ХОФФ&

Фоххх

gu О,qc0

Fl 5 & c0 !»

)1

I

1 !

О ф

I !

- о л

1 х

Ф Ф ф ф 1< Яс

Ю л м

& 1-1

Ф Ф

О Е В; л

Ш E E

3х х Ф3 о х м

1 cd I.Ý Ф

E I I E хФ ц О

1о! оо

О 1 t» Х

О !

О

Ф

1» Ц

1 1 Х а о

О 1 О

1 В

1 Ю

I Е

I Х

1 Ф

1 С»

1 Ф

cd

С4 о

Е

& Ж о

И1ф

v v ж ж

Kl FCI о ц ж ж

FCI Kl о о о

v 1

Ь вЂ” — — — »

g!

X ь

С

Г-ю л

А о

1 о

1 К

I Х о о

I й

1 О

X о

Ф х и о

Х

4 о л л о оо о oo oo л л л о — о о

I 1с 4с

4С М 31 о о л r- м л л л о сч an м>

Г1 Г1 м iM !. о

Ф 00

4О Ч С а л л л л л л о сч л м и л л 1Г л о сч»»» о î о

Cl л л л о о

СЧ СМ и о а в л л л л о

1 а О I

1

I о л

II о о х х х о, Й х х х йиi

О. Р. g4 о о о ф 31