Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы нгук-1,используемый для изоляции полевых штаммов рабического вируса,экспресс-диагностики бешенства, определения глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона

Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы нгук-1,используемый для изоляции полевых штаммов рабического вируса,экспресс-диагностики бешенства, определения глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы НГУК-1 (коллекция соматических перевиваемых клеток позвоночных Института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко), используемый для изоляции полевых штаммов рабии ческого вируса, экспресс-диагностики бешенства, определения глиотоксич (Л ности сывороток крови и титрования интерферона. .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (1 1) 00 (51) 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К A8T0PCK0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3694674/28-13 (22) 23.01.84 (46) 07.08.85. Бюл. ¹- 29 (72) А.П. Авцын, В.Я. Кармышева, Л.И. Кондакова, Н.В. Овсянникова, M.À. Селимов, А.Г. Татаров и А.С. Халанский (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР и Институт морфологии человека.АМН СССР (53) 576.8.093(088.8) (56) Бенюмович М.С., Тимофеевский А.Д., Архангельский В.В. Длительные культуры — клеточный штамм — дедифференцированной астроцитомы человека.

Вопросы нейрохирургии 1962, т. 26, ¹ 5, с. 1 5. (54) !IITAMN IIEPEBHBAEMbIX KIIET0K НЕВРИНОМЫ ГАССЕРОВА УЗЛА КРЫСЫ НГУК-1, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗОЛЯЦИИ ПОЛЕВЫХ

ШТАММОВ РАБИЧЕСКОГО ВИРУСА, ЭКСПРЕСС

ДИАГНОСТИКИ БЕШЕНСТВА, ОПРЕДЕЛЕНИЯ

ГЛИОТОКСИЧНОСТИ СЫВОРОТОК КРОВИ

И ТИТРОВАНИЯ ИНТЕРФЕРОНА. (57) Штамм перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы НГУК-1 (коллекция соматических перевиваемых клеток позвоночных Института экспериментальной ветеринарии им. Я.P. Коваленко), используемый для изоляции полевых штаммов рабического вируса, экспресс-диагности- Ж ки бешенства, определения глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона.

1139 166

Изобретение относится к цитологии и вирусологии.

Известен штамм глиальных переви- ваемых клеток из дифференцированной астроцитомы человека, полученный в

1961 r в СССР (1j.

Однако к настоящему времени штамм утерян.

Целью изобретения является создание нового штамма перевиваемых 10 глиальных клеток, способного культивироваться на отечественных средах, отвечающего мировым стандартам и пригодного для вирусологических исследований. 15

Эта цель достигается с использованием штамма перевиваемых клеток невриномы гассерова узла крысы

НГУК-1. Штамм депонирован в коллекции соматических перевиваемых клеток 20 позвоночных Института экспериментальной ветеринарии им.Я.P.Êîâàëåíêî.

Штамм перевиваемых клеток НГУК-1 получен путем последовательного пассирования индуцированной этил- 25 нитрозомочевиной опухоли гассерова узла крысы во флаконах с питательной средой и на восприимчивых животных.

Штамм характеризуется следующими морфологическими и биологическими свойствами.

Клетки имеют полигональную форму с тонкими отростками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро содержит мелко- и крупнозернистый хроматин 35 с 2-3 ядрышками. В штамме НГУК-1 сохраняется околодиплоидное число хромосом. При постановке пробы на глиоспецифический белок 5 †1 обнаружена положительная реакция. 40

Клетки НГУК-1 образуют монослой на 3-4 сут роста при исходной плотности пассирования 150 тыс. клеток на 1 ип, при большей плотности пассирования — на 2 сут . Максимальный <5 митотический индекс — 2,57. Штамм

НГУК-1 не контаминирован бактерияьж, грибами, микоплазмами. Клетки

НГУК-1 сохраняются в жидком азоте беэ снижения пролиферативной актив- 50 ности. При хранении более 2 лет (время наблюдения) сохраняют жизнеспособность на 75-807. Клетки

НГУК-1 способны оставаться на стекле без субкультивирования и смены 55 среды в течение 5-7 сут, чувствитель ны к различным вирусам (уличного бешенства, везикулярного стоматита, Синдбис, клещевого энцефалита, Коксаки A7), пригодны для определения и титрования глиотоксичности сывороток крови и титрования интерферона.

Пример 1. Выделение полевых штаммов рабического вируса и экспресс-диагностика бешенства.

Монослой клеток линии НГУК-1

7 выращенный в 0,1 или 0,25 л матрасных колбах, обрабатывают 0,0257.-ным раствором версена в течение 1,5-2 мин при комнатной температуре. Версен сливают и в колбу вносят 2-3 мп питательной среды Игла MEN с глутами= ном (657), телячьей сывороткой (157), сывороткой крупного рогатого скота (157) и куриным эмбриональным экстрактом (57) и по 100 ед. пенициллина и стрептомицина. Клетки разбивают при легком покачивании колбы или с помощью пипетирования. Далее вносят среду Игла МЕМ, чтобы концентрация клеток "îñòàâëÿëà 500 000 на 1 мл. Зятем взвесь клеток переносят в бактериологические пробирки, содержащие на дне предметные стекла размерами 5х20 мм, и помещают их в термостат (37 С) . Монослой формируется через 48 ч с момента посадки.

Исследуемый и контрольный материал (мозг или подчелюстные железы человека или различных животных, сохраняемые при -20 С) размельчают в асептических условиях, готовят

107-ную взвесь в фосфатном буферпом растворе с рН 7,2, центрифугируют при 5000 оборотов в минуту в течение 10 мин.

Надосадочную жидкость с антибио. тиками сохраняют при 2-4 С.

Перед заражением культуры пр обирки с предметными стеклами микроскопируют при увеличении 5 х 7 и отбирают пробирки с удовлетворительным монослоем клеток. Ростовую среду удаляют, монослой клеток промывают раствором Эрла и на него вносят 0,3 мл исследуемого материала для адсорбции в течение 1 ч при комнатной температуре. Исследуемый материал удаляют и в каждую пробирку вносят по 2, 5 мл среды Игла МЕМ с указанными выше добавлениями.

В качестве контроля используют нормальную мозговую взвесь и заведомо положительный вируссодержащий материал. Для каждого исследуемого и з 11 контрольного материала берут по 2 пробирки с клеточными культурами.

Для заражения во взвеси 2 мл концентрированной взвеси клеток соединяют с равным объемом исследуемого или контрольного материала (1000-500 ЛД вируса при интрацеоО ребральном титровании на мышах), выдерживают для адсорбции в течение

1 ч при комнатной температуре при периодическом сбалтывании пробирок, затем концентрацию клеток доводят до 500000 в 1 мл и по 2,5 мл взвеси клеток разливают по пробиркам, содержащим предметные стекла.

Пробирки с предметными стеклами, контрольными и зараженными на монослое или во взвеси, помещают в термостат (35 С). Через 72 ч питательную среду с пробирок удаляют, монослой клеток промывают раствором Эрла, предметные стекла с монослоем клеток фиксируют в холодном (2 С) ацетоне в течение 10 мин и окрашивают коммерческим флюоресцирующим диагностическим антирабическим гамма †глобулин в разведении, соответствующем четырехкратному кра сящему титру. Препараты промывают и высушивают IIQ o rrrerrprIHIITon Meтодике.

Препараты просматривают под лю- . минесцентным микроскопом при увеличении 7х90. В цитоплазме клеток, зараженных заведомо положительным или исследуемым положительным материалом, при отсутствии цитопатических изменений обнаруживают типичные зеленовато-желтые ярко светящие ком— нлексы-включения. В клетках, обработанных нормальной мозговой взвесью, специфических флюоресцирующих цитоплазматических включений не обнаруживается.

Пример 2. Определение глио— токсичности сывороток крови.

Линию НГУК-1 выращивают по указанному в примере 1 способу в иммунологических панелях на 96 лунок с плоским дном в термостате с 0,5Х углекислого газа или в эксиматоре с зажженной свечой при 37 С. В каждую лунку вносят по 3 капли клеточной взвеси. После образования монослоя удаляют среду и в лунки заливают последовательные разведения исследуемых сывороток (от 1:2 до 1: 128 и выше), используют по три лунки

39166 на каждое разведение и ставят на контакт в тот же термостат на 1 — 1,5 ч °

Учет результатов проводят в инвертированном микрбскопе по появлению токсического эффекта: изменение формы клеток, округление, утрата отростков, деструкция, разрежение монослоя или образование скоплений разрушенных клеток. Титр глиотоксичности сывороток учитывают по максимальному разведению, дающему такие изменения. При отсутствии глиотоксичности морфологии культуры не изменяется.

10 логии позволит значительно упростить и удешевить изоляцию полевых штаммов

,рабического вируса, экспресс-диагнос-» тику бешенства, индикацию и титро вание глиотоксичности сывороток и титрование интерферона.

Пример 3. Титрование интерферона.

Из пробирок с выращенной линией

НГУК-1 сливают поддерживающую среду и вносят в них приготовленные на среде Игла четырехкратные (с 1:4 до

1: 1024) разведения интерферона в объеме 1 мл на пробирку, используя по 4 пробирки на каждое разведение.

Контакт клеток с интерфероном при о

37 С вЂ” 6 ч. Затем, слив из пробирок содержимое, вносят вирус везикулярного стоматита в дозе 100 ТЦД coso держащейся в 1 мл, в пробирки с клетками линии НГУК-1, предназначенные для контроля действия вируса (К/В), .30 и пробирки из-под интерферона. В пробирках с клетками линии НГУК-1, предназначенных для контроля ткани (К/Т), поддерживающую среду заменяют средой Игла. Все культуры инкубируют при 37 С до развития четкого цитопатического эффекта в пробирках с К/В. В это время производят учет опыта. Титр интерферона определяют по защите 507. культур клеток от

40 цитопатогенного действия 100 ШД О вируса везикулярного стоматита. В нашем примере титр мышиного интерферона в культуРе НГУК-1 составляет

126 ед/мл (при учете опыта через

45 48 ч после внесения вируса). При одновременно проведенном титровании того же интерферона в первичной культуре клеток мышиных эмбрионов титр интерферона 174 ед/мп и титрова. ние могло быть учтено на сутки позже (через 72 ч после внесения вируса).

Использование изобретения в вирусо