Способ получения эритроцитарного диагностикума

Способ получения эритроцитарного диагностикума

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛУг1ЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО даЛГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, от л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьшения выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой , взятой в концентрации О,15-. , 0,8 мг на 1 мл сенситина.

(l9) 0 1) СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

8 А

4(5ц А 61 К 39/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

"Ф "са Д (2i ) 3558529/28-13 (22) 25.02.83 (46) 23.,02.85. Бюл. Х - 7, (72) Н.Н.Басова, И.В. Далин, В.Н. Беднова и Г.Ф. Тимченко (71) Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии и

Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт (53) 615.373(088.8) (56) 1. Регламенты на изготовление дифтерийного и столбнячного эритроцитарных диагностикумов Ф 12-13. .ТУ-42 КВС Ф l5-16. 24.04,74 (прототип) ° (54) (57) 1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРО-

ЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА путем стабилизации эритроцитов, обработки их дубильной кислотой с последующей сенсибилизацией, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повьппения выхода целевого продукта, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы сенсибилизируют гомологичным сенситином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации. 0,150,8 мг на 1 мл сенситина.

1140788

Изобретение относится к биологии и медицине, преимущественно к иммунодиагностике и иммунохимии, и может быть использовано в производстве эритроцитарных диагностикумов различной специфичности и в научных исследованиях.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума путем стабилизации эритроцитов, обработки их ду- 10 бильной кислотой с последующей сенсибилизацией (1).

Однако известный способ не позволяет получать однородные по качеству серии циагностикумов. f5

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения эритроцитарного диагностикума путем ста- 20 билизации эритроцитов,,обработки их дубильной кислотой с последующей . сенсибилизацией, стабилизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы,сенсибилизируют гомологичным сен- 25 ситином,предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15-0,80 мг на 1 мл сен«ситина, 30

Способ выполняется следующим образом.

Для приготовления эритроцитарных диагностикумов (дифтерийного, столбнячного трепонемного) могут быть ис1

35 пользованы стабилизированные эритроциты млекопитающих, птиц, не подвергавшихся ранее сенсибилизации белковыми или другими сенситинами, а также представпяющие собой производст40 венный брак (серии, слабые сразу после изготовления или утратившие активность.в результате хранения) .

Стабилизированные эритроциты под вергают последовательно процедуре 4> отмывания (солевые растворы с детер: гентом, например твин-80, в концентрации от 1: 10000 до 1:100000) затем обрабатывают веществами-присоединителями, например, дубильной кислотой 50 (от 1: 10000 до 1:80000, преимущественно 1:20000), при 20-37 С в тече- . ние 20 мин — 12 ч с последовательным отмыванием. 0,85Х-ным раствором хлорида натрия, рН = 5,9-6,4. 55

Подготовленные эритроциты суспенди-, руют в забуференном 1: 100 (1/15 M фосфатного буфера) 0 85Я-ном растворе хлорида . натрия при рН = 5,9-6,4 до концентрации 2,5-5Х.

Эту взвесь соединяют с эффективной дозой сенситина, установленной в. предварительном опыте, и смесь инкубируют при 37 — 45 С в течение

3-5 ч. По истечении этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид (до 17-ной концентрации в объеме}.

Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производят в присутствии 1Х-ного формальдегида.

Готовые препараты испытывают в

РПГА со стандартной диагностической сывороткой для определения специфической активности.

Сопоставление условий сесибилизации показало, что в пределах рН =

= 5,9-6,4 .обеспечивается наиболее эффективное присоединение сенситинов, например, дифтерийного,столбнячного или сониката патогенных бледных трепонем, что проявляется наивысшими титрами соответствующих стандартных сывороток в РИГА.. При этом эффективная концентрация сенситина обеспечивает достижение максимальной активности полученного диагностикума как из

2157.-ной так, из 57-ной взвеси подготовленных эритроцитов, а получение трепонемного эритроцитарного диагностикума возможно при использовании полученного известным способом в экспериментальных условиях ультразвукового антигена в дозе

0,2 мг белка на 1 мл взвеси эритроцитов. Повышение дозы сенситина от 0,2 До 2 мг белка íà 1 мл взвеси эритроцитов способствует повьппению активности диагнос1икума на 2-3 раз.. ведения (1:2п), дальнейшее. же повышение дозы белка снижает активность полученной серии диагностикума. Кроме того, обработка веществами-присоединителями (например, дубильной кислотой) может производиться с равным успехом в течение 30 мин—

16(18} ч при 20-37 С, причем сенситиы перед присоединением к подготовленным эритроцитам обрабатывают сульфосалициповой кислотой в дозе, обеспечивающей стойкую опалесценцию конкретного белкового коллоида.

Пример 1. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритро" цитарных диагностикумов формалинизированные эритроциты бара на,не под1140788

Пример 3. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагно- . стикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают аналогично примерам 1 и 2 до этапа сенсибилизации.

Полученный известным способом в экспернментальных условиях соникат патогенных бледных трепонем стандарти;зируют цо содержанию белка (метод вергавшиеся ранее сенсибилизации, по= следовательно отмывают 0,857.-íûì раствором хлорида натрия, затем — раство- ром детергента (например, твина — 80) . и снова 0,85Х-ным раствором хлорида натрия. Полученный осадок ресуспендируют и соединяют с раствором глютарового альдегида. После контакта осадок ресуспендируют, осаждают. центрифугированием, осадок снова ресуспендиру- 1п ют, отмывают 0,857-ным раствором хлорида натрия, вновь ресуспендируют в.изотоническом растворе хлорида натрия., в котором содержится дубильная кислота. После взаимодействия эритроциты осаждают, осадок промывают 0,85Х-ным раствором хлорида натрия с детергентом (твином-80), затем — без детергента. Сенситин прогревают при 65 С в течение 1 ч и быстро охлаждают при 0 С (вода со льдом) . Затем к нему по каплям постепенно добавляют 1%-ный раствор сульфосалициловой кислоты до появления стойкой опалесценции. 25

Ресуспендированные эритроциты, подготовленные, как описано ранее, соединяют с обработанным гомологичным сенситином и помещают на 5 ч в водяную баню при 45 С. По истечении этого срока к каждой смеси добавляют формальдегид до 17-ной концентрации в объеме. Последующее отмывание сенсибилизированных эритроцитов и хранение готового препарата производится в присутствии 17-ного

35 фо рмальде гида.

Пример 2. Для приготовлення дифтерийного или столбнячного эритроцитарных диагностикумов фор40 малинизированные эритроциты барана, ранее подвергавшиеся сенсибилизации дифтерийным или столбнячным анатоксинами, последовательно обрабатывают аналогично примеру 1 с использовани45 ем одноименного сенситина — дифтерийного или столбнячного.

Лоури) и применяют в качестве сенситина в концентрации, соответствующей

0,2 мг/мл на 1 мл 2,57-ной взвеси подготовленных эритроцитов, взаимодействие с которым происходит в присутствии забуференного 1:100 (1/15 М фосфатного буфера) 0,857.— ного раствора хлорида натрия (рН

5,9) в течение 40 мин при 38 С

Hp и м е р 4. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примерах 1 и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка

2 мг/мл на 1 мл 2,57.-нсй взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 6,4) в течение 45 мин при 38 С.

Пример 5. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают как в примере 1 и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка

0,2 мг/мл на 1 мл 57-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 6,4) в течение 40 мин при 37 С.

Пример 6. Для приготовления трепонемного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты. барана, ранее не подвергавшиеся сенсибилизации, последовательно обрабатывают, как в примере

1 и 3, но для сенсибилизации используют сенситин с концентрацией белка

cj

2 мг/мл на 1 мл 5Х-ной взвеси подготовленных эритроцитов (рН = 5,9} в течение 30 мин при 38 С.

По предлагаемому способу были подвергнуты повторной обработке

4 л 720 мл взвесей эритроцитов активностью 0,006-0,0015 AE/ìë, 917 которых сохранили этот показатель в течение 12-18 месяцев.

При сравнении 15 серий столбнячного анатоксина ранее можно было расчитывать на пригодность из них

2-3, а по новой технологии было получено 10 серий препарата с активностью 0,006 (2); 0,003 (3); 0,0015 (2); 0,008 (3) AE/ìë. При сравнении ,36 серий дифтерийных анатоксинов ! разного производства 25 оказались пригодными для получения высоко чув1140788 ствительных диагностикумов активностью 0,006-0,0002 AE/ìë. Кроме того, 6 л 170 мл (650 серий) дифтерийного диагностикума и 5 л 950 мл (720 серий) столбнячного диагностикума было получено с помощью воздействия сульфосалициловой кислотой, причем активность препарата значительно превысила обычные показатели:

0,0008-0.0002 АЕ/мл (дифтерийный), 0,003-0,0008 AE/мл(столбнячный). Сроки сохранения активности для 897 серий превысили 12 месяцев. Эти коли" чества препарата в условиях постановки РПГА микрометодом обеспечивают обследование более 300 тыс.человек.

Применение сульфосалициловой кислоты позволило присоединить к стабилизированным эритроцитам через танин или глютаровый альдегид и танин ранее не присоединявшийся антиген — соникат патогенных бледных трепонем— и приготовить 19 серий нового диагностического препарата. Титры анти- . тел в PHIA с. трепонемным эритроци тарным диагностикумом колеблются от 1:64 до 1: 1024 при ранних формах сифилиса и от 1:2000 до 1:32000 при поздних формах этого заболевания.

Диагностикум сохранял свою активность в течение 3 мес (срок наблюдения), Пример 7. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагноСтикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного .сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,15 мг на 1 мл сенситина.

Пример 8. Для приготовления дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают,. как в примере 1, с использованием одноименного.сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,2 мг на .1 мл сенситина. " "П р и. м е р 9. Для приготовления дифтерийного или стоблнячного .эритроцитарного диагностикума форма. линизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последователь но обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации ОЯ мг 1 мл сенситина.

Hp и м е р 10. Для приготовле— ния дифтерийного или столбнячного эритроцитарного диагностикума формалинизированные эритроциты барана или нестандартные серии эритроцитарных диагностикумов последовательно обрабатывают, как в примере 1, с использованием одноименного сенситина, предварительно обработанного сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,85 мг на 1 мп сенсиПо предлагаемому способу были сенсибилизированы формалинизированные эритроциты и нестандартные диагностикумы дифтерийным или столбнячным анатоксином, предварительно обработанным сульфосалициловой кислотой, взятой в концентрации 0,150,85 мг на 1 мл анатоксина. Сопостав30, ление полученных результатов дано в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ производства или экспериментального приготовления эритроцитарных диагностикумов повышает возможнос35 ти использования формалинизированных эритроцитов из числа отбракованных серий sa счет повторной обработки, а также позволяет использовать в ка40 честве сенситинов дополнительные серии коммерческих полуфабрикатов вакцин, сывороток для изготовления эритроцитарных диагностикумов высо кой специфичности и чувствительности.

Предлагаемый способ приготовления эритроцитарных диагностикумов обеспечивает по сравнению с известным способом возможность повторного

S0 использования формалинизированных эритроцитов (утилизации производственного брака и серий, вышедших из срока годности) путем повторной их обработки веществом-присоединиЫ телем и одноименным сенситином, использования в 6-8 раз большего числа производственных образцов полуфабрикатов сенситинов (например, ана8

1140788

Носитель

Диагностикумы

Количество проб

1 1

Дифтерийный

/ формалинизированный 1080 52 68,5 70,3 65,6 43,1

Столбнячный эритроцитарный

225 50,2 60,1 67,6 58,9 47,0

Дифтерийный нестандартный

720 59 0 72 3 75 6 68 4 53 4

340 64,3 74,0 83,5 79,0 61, 1

Столбнячный

Составитель П.Бонарцев

Редактор Н. Лазаренко Техред Т.Маточка

Корректор В. Бутяга

Заказ 360/5 Тираж 722

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 токсинов) для получения эритроцитарных диагностикумов высокой специфичности и чувствительности за счет обработки белковых коллоидов сульфосалициловой кислотой, а также возможность присоединения к эритроцитам ряда веществ белковой природы, в том числе полученных в экспериментальных условиях, не сенсибилизирующих эритроциты известным способом, например сониката патогенных бледных трепонем, при изготовлении эритроцитарного диагностикума этой специфичности.

Выход стандартных серий препарата, 7, при концентрации сульфосалициловой кислоты, мг/мл

015 02 06 08 085