Способ определения антител к гликолипидам @

Способ определения антител к гликолипидам @

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ AHТИТЕЛ К ГЛИКОЛИПИДАМ Re путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрь липосомы, проведения реакции комплементзависимого лизиса с .последующим потенциометрическим определением по выходу маркера из лизированных липосоМ, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве маркера используют анион фтора. «о

„„SU„„1141 36 A

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(5!) G 01 N 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

"Ф. Ф 5ЙЭ. ф

1 %г(4" Ж .1 + (ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -"-

К ABTOPCHOlVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

i (21) 3521752/28-13(22) 13.12.82 (46) 23.02.85. Бюл. 9 7 (72) Г.С.Власов, В.П.Торчилин, T.A.Ãðåìaêoâà, В.Г.Лиходед, М.Д.Коростелева и Н.Н.Иванов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр ANH СССР и Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. Н.И.Мечникова (53) 616.07(088.8) (56) 1 ° Иimmermaп D., Verh М. ; A simple procedure for labelling

the lipid,. A moi1ty of L ШЬ.—

125 IAnal Biochem. 1 977, 77, 340.

340-345 °

2. Shiba К., Watanabe Т., Uniezawa Y. Fujcwara S — Liposome

immunoelectrode. Chem. Lett., 1980,2

155- 158. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ГЛИКОЛИПИДАМ Ве путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрь липосомы, проведения реакции компле.: ментзависимого лизиса с последую-" щим потенциометрическим определением по выходу маркера из лизированных липосоМ, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве маркера используют анион фтора.

1141336

Изобретение относится к медицине, в частности к методам определения антител к липидным антигенам.

Иэвестен способ определения антител к гликолипидам Re и лепиду A радиологическим методом (1) .

Изнестен также способ определения липидных антигенов с помощью содержащих в качестве маркера ион тетрапентиламмоний (TIIA ), сенсибиФ лизированных линосом и TIIA ионселективного электрода f2j . ,Недостатки способа заключаются в том, что необходим специальный синтез маркера и наличие н биологических системах ионов NR4,анало+гичных маркеру.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что согласнО способу определения антител к гликолипидам Re путем встраивания липидного антигена в мембрану липосом, включения маркера внутрь липосомы, проведения реакции комплементзависимого лизиса с последующим потенциометрическим определением по выходу маркера из лизированных липосом,в качестве маркера используют анион фтора.

Способ осуществляют следующим образом.

Re-вакцину готовили следующим образом: культуру мутанита Ба1воnella minisota R595 o arapa Xor.zsrepa смывали физиологическим раствором, доводили до концентрации

109м клеток н 1 мл по оптическому стандарту ГИСК им,Тарасевича, прогревали 2 ч при 56 С и хранили при о

4 С не более 30 дн.Перед иммунизацией животных Не-вакцину ресуспендиронали, разводили стерильным физиологическим раствором до 10 клеток в l мл.

Вводили вакцинный препарат внутривенно по следующей схеме:

1 день 0,25 мл; 5 день 0,5 мл;

9 день 1,0 мл; 14 день 1,0 мл. На

21 день брали. 40 мл крови, отделяли сыворотку центрифугированием:

Перед постанонкой пробы гиперимунную сыворотку прогревали при

56 С 30 мин для инактивации комплео мента и разводили ее ЭФР 1:100. I

Гликолипиды Re (ГЛ-Re) выделяют хлороформ-метанольной экстракцией из мутанта Salmonella minisota

R595.Ëèïèäû A (JIA) получают из ГЛ-Re кислотным гидролизом.

Для реакции конкурентного ингибирования ГЛ-Re u JIA переводят в нодорастворимое состояние комплексированием с бычьим сывороточным альбумином (БСА) в присутствии триэтиламина.

60

65 .регистрировали через 3 мин. Для оп3S

Титры кроличьих гиперимунных

;и контрольных сывороток предварительно оценивают по результатам реакции пассивной гемагглютинации (РПГА).

РПГА проводят с формалипизированными эритроцитами человека гр.0(1)Р(-, .сенсибили."зированными ГЛ-Re.Êîìïîíåíò исследуемых сывороток инактивируют прогреванием в течение 25-30 мин при 55-56 С. В реакции использован комплект сыворотки морской свинки (180 СН в 1 мл).

Липосомы готовят, используя яичный лецитин (Лн), холестерин (Х), дицетилфосфат {ДФ) и ГЛ-Re н молярном соотношении Лн:X:ÄO:ÃË=2:1, 5:О, 2:0,05 (обоснование соотношения представлено в У,УП условиях осуществления способа). Контрольные липосомы получают без гликолипида.

Раствор липидов и хлороформе, содержащий 15 мг Лн; 5,8 мг Х; 1,2 мг ДФ и 1 мг ГЛ-Re, высушивают на роторном вакуумном испарителе до образования липидной пленки. К высушенной липидной пленке добавляют 0,9-1,9 мл

0,14-0,15 М NaF; 0,120-0,125 М

Na HPO4, рН 7,3-7,4, тщательно встряхивают до образования гомогенной суспензии и озвучивают 4-5 раз по 20-30 с с охлаждением до 4-6 С.

Невключившийся фторид натрия удаляют в течение 50-60 мин диализом против забуференного физиологического раствора (ЗФРу 0,120-0,1 5 М

Na НРО4,. 0,145-0,147 М Nacl. рН 7,37,4) при соотношении объемов 1:9001:1000. Процент удаления маркера контролируют измерением содержания ионов фтора ионселективным электродом в диализируемом растворе.

Определение титров Re-антител в гипериммуной сыворотке кролика проводили следующим образом: в пять пробирок добавляли 100 мкл суспензии сенсибилизированных липосом, 4 мкл комплемента {титр 180 СН,в

1 мл) и различное количество гиперимунной сыворотки (разведенной

1:100). Объем каждой пробы доводили до 200 мкл ЭФР. Кроме этого ставили три контроля: пробы без комплимента, без гипериммунной сыворотки и с сывороткой неиммунизированных кролио ков. Пробы инкубировали при 20 С в течение 30 мин. Коцентрацию ионов фтора определяли в объеме 100 мкл.

На пластинчатый Ад/АдС1 электрод сравнения помещали 100 мкл пробы и в вертикальном положении фотоселективный электрод (ЭР-VI). Анализируемый раствор занимал пространство между мембраной селективного электрода и пластинкой электрода сравнения.

Разность потенциалов определяли с помощью универсального иономера

ЭР-74, значение показаний электрода

1141336

Составитель И.Емельяненко

Техред М. Пароцай КорректорС.Черни

Редактор A.Øèøêèíà

Подписное комитета СССР и открытий

Раушская наб °, д.4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 ределения разности потенциалов пос- ле полного разрушения липосом к

100 мкл исходной суспенэии сенсибилизированных липосом добавляли

80 мкл эабуферного физраствора и . 20 мкл (1,25%) тритон. 5

Пример 1.Кролика иммунизировали по стандартной методике много- кратно внутривенно Re вакциной, полученной иэ мутана Salmonella minisota R595, для определения иммуногенности четырех серий вакцинных препаратов. Титры Re-антител в кроличьих сыворотках оценивали описанным потенциометрическим методом .в реакции иммунного комплементэависимого лизиса липосом. Титры антител к гликолипидам Re для четырех серий вакцинных препаратов состави ли 1:20000; 1:20000; 1:20000 и

1:5000.

Пример 2. Иммунизацию кро- 20 лика и определение титров антител к

Заказ 489/33 Тираж 897

ВНИИПИ Государственного по делам изобретений

113035, Москва, Ж-35, гликолипидам Re для четырех серий вакцинных препаратов производили по примеру 1. Титры антител составили 1:20000; 1:20000; 1з20000 и

1:5000.

Изобретение упрощает метод выявления антител к липидным антигенам за счет использования доступного марКера (NaF) и фторселективного электрода. Использованный в качестве маркера анион фтора практически отсутствует в биологических системах и не влияет на реакцию иммунного взаимодействия, так как степень тормозящего воздействия ионов в формировании иммунных комплексов параллельна обычному липотропному ряду. Кроме того, потенциометрический липосомальный метод в

10 раз чувствительнее, чем известные - технические решения.