Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий

Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами,сенсибилизированными гликолипидом из мутанта Salmonella minnesota R595 отличаю й( йен .тем, что, с целью повышения специфический чувствительности способа, исследуемые пробы предварительно обрабатывают 0,10-0,25 М раствором гидроокиси натрия при 56-100° С в т.ечение 10120 мин с последующей нейтрализацией раствором соляной кислоты.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(51) A 61 К 39 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ЗСЕГ() Жрг;, у

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЖ (21) 3493909/28-13 (22) 23.09.82 (46) 28.02.85. Бюл.Р 8 (72) В.Г.Лиходед, Т.A.Ãðåìÿêîâà и A.Ñ.Ñàåíêî (71) Московский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток . им.Мечникова (53) 576 ° 8.093.1(088.8) (56) 1.Авторское свидетельство СССР

Р 1017339, кл.A 61 К 39/00,1983. .(54)(57) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ГРАМОТРИЦДТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ

„„Я0„„1142122 А путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами,сенсибилизированными гликолипидом из мутанта Salmonella minnesota R595 T л и ч а ю щ-и и с я .тем, что, с целью повышения специфической чувствительности способа, исследуемые пробы предварительно обрабатывают

0,10-0,25 М раствором гидроокиси натрия при 56-1000С в течение 10120 мнн с последующей нейтрализацией раствором соляной кислоты.

1142122

Изобретение относится к медицине, а именно к способу выявления эндотоксинов (липополисахаридов) грамотрицательных бактерий с различной ,антигениой специфичностью боковых углеводородных цепей. 5

Известен способ выявления липида

А или гликолипида путем проведения реакции торможения пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов, сенсибилизированных гликоли- )0 пидом или липидом А (1).

Основной недостаток этого способа состоит в том, что он позволяет выявлять липид А или гликолипид лишь после их предварительного химичес- 15 кого выделения из липополисахаридов или иэ бактериальных клеток. В отношении липополисахаридов, циркулирующих во внешней среде или в организме человека и животных, этот способ характеризуется крайне низкой чувствительностью, так как нативные .: липополисахариды практически не тормозят реакцию пассивной гемагглютинации с Гликолипидным или липидным 25 диагностикумами.

Целью изобретения является .повышение специфической чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий путем постановки реакции торможения пассивной гемагглютинации исследуемой пробы с эритроцитами, сенсибилизированными гликолипидом из

: мутанта Salmonella minnesota R595 исследуемые пробы предварительно обрабатывают 0,10-0;25 M раствором гидроокиси натрия при 56-100 С в тео чение 10-120 мин с последующей нейт- 40 ралиэацией раствором соляной кислоты.

Способ осуществляют следующим образбм.

Получение гликолипида. 30 г лис- 45 фильно высушенной биомассы мутанта

Salmonella minnesota R595 экстрагируют трижды смесью хлороформ:метанол в соотношении 4:1, Объем смеси при первой экстракции составляет 450 мл, при последующих двух — по 200 мл.

Объединенные экстракты доводят метанолом до конечного соотношения хлороформа и метанола, равного 1:2, и оставляют на 2 ч при 4 С,затем осадок, содержащий гликолипид, отделяют центрифугированием в течение

20 мин при 6000 об/мин.. Полученный осадок переосаждают трижды при помощи той же процедуры, после чего высушивают на воздухе. Выход су- 60 хого продукта — около 850 r. Препарат гликолипида хранят в высушенном виде при 4 С.

Получение формалинизированных эритроцитов. Свежие эритроциты от- 65 мывают 0,15%-ным раствором хлористого натрия от плазмы и суспендируют в стандартном солевом растворе (CCP), содержащем 4,5 r цитрата, 8,8 r хлористого натрия в 1 л дистиллированной воды, до 5%-ной концентрации и диализуют против формалина (1/5 объема формалина от объема взвеси эритроцитов) в течение 5-6 сут при 4-6 С, периодически помешивая.

После диализа эритроииты отмывают

ССР, готовят 50%-ную взвесь в CCP c

1% формалина и хранят при 4 С.

Получение водорастворимого гликолипида. 10 мг гликолипида растворяют в 10 мл деионизированной воды при добавлении триэтиламина до конечной концентрации 1%. Затем добавляют

0,.5 мл раствора, содержащего бычий сывороточный альбумин в концентрации 2 мг/мл, перемешивают и отгоняют триэтиламин на роторном испарителе. Затем раствор, содержащий комплекс гликолипида с SCA, разводят в 5 раз 0,2 M фосфатным буфером рН

6,4 до концентрации гликолипида

200 мкг/Мл.

Сенсибилизация эритроцитов. 5 мл

50%-ной суспензии формализированных эритроцитов трижды отмывают CCP от формалина. .5 мг танина растворяют в 195 мл забуференнога физиологического раствора (ЗФР) рН 7,2 (100 мл

0,15 М раствора хлористого натрия +

100 мл 0,15 М натрия-фосфатного буфера), суспендируют в этом же раст-. воре формалинизированные эритроциты, инкубируют 10 мин при 37 С и отмывают дважды ЗФР путем центрифугирования при 2500 об/мин в течение 15 мин.

К осадку добавляют 50 мл ЗФР ( (рН 6,4), содержащего комплекс гликолипида с БСА в концентрации 200 мг гликолипида в 1 мл. Смесь инкубируют

30 мин при 37 С, отмывают трижды

ССР, содержащим 0,03% SCA (ССР-SCA),. готовят 1%-ную суспечзию эритроцитов в этом же растворе, добавляют формалин до конечной концентрации 1% и хранят при 4 С.

Щелочный гидролиз эндотоксинов.

2 мг ЛПС растворяют в 0,75 мл дистиллированной воды, содержащей 0,05 M этилен-диаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), и добавляют 0,25 мл 1М

NaOH. Смесь выдерживают при 56 С 1 ч.

Концентрация щелочи варьирует в пределах 0 1-0,25 М, температура—

56 — 100 С, а время обработки †.10

120 мин. После гидролиза раствор нейтрализовали 10 М НСХ.

Постановка реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). Для РПГА использовали 1%-ную взвесь сенсибилизированных эритроцитов в CCP-SCA. Сыворотки перед исследованием прогревали 30 мин при 56 С. Б качестве растворителя применяли 0,1 М мединал1142122 вероналовый буфер (MBE) рН 8,6 ° Реакцию ставили в полистироловых пластинах. В каждую лунку вносили по

50 мкл растворителя. В первую лунку затем вносили 50 мкл сыворотки к гликолипнду и готовили двукратные разве-.5 дения. Затем в каждую лунку добавляли по 25 мкл взвеси эритроцитов.Пластины выдерживали 1 ч при комнатной температуре и затем определяли последнее разведение сыворотки, в котором 10 наблюдается гемагглютинация.

Постановка реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА).

В каждую лунку вносят по 25 мкл растворителя для РПГА. Затем в первую 15 лунку вносят 25 мкл раствора гликолипида в концентрации 100 мкг/мл или исследуемого раствора до и после обработки щелочью и готовят двукратные разведения. После этого в каждую 20 лунку добавляют по 25 мкл сыворотки к гликолипиду, разведенной в 2-4 раза меньше ее титра, и по 25 мкл 1%-. ной суспензии сенсибилизированных эритроцитов. Пластины выдерживают l ч при комнатной температуре и затем определяют минимальную концентрацию гликолипида, тормозящую PIIFA, а также минимальную концентрацию исследуемого эндотоксина, вызывающую РТПГА.

Предложенный способ по сравнению с известным обеспечивает повышение. специфической чувствительности.

Пример 1. Ингибирование

РНГА различными ЛПС.

Результаты торможения РПГА различ-З5 ными ЛПС. до и после их обработки щелочью (0,25 M NaOH, 56 С, 1 ч)представлены в таблице.

Как видно из таблицы, различные

ЛПС тормозили РПГА с гликолипидным 40 диагностикумом в концентрациях,превышающих 2000 мкг/мл (дополнительные эксперименты показали,что для . торможения необходима концентрация .нативного ЛПС не менее 10 мкг/мл). 45

Ч

Однако после щелочного гидролиэа ингибирующая активность ЛПС резко возрастала — минимальные ингибирующие концентрации колебались для различных препаратов ЛПС от 4 до

50 мкг/мл.

После обработки щелочью ЛПС сохраняли способность тормозить РПГА с

0-антигенными эритроцитными диагностикумами, т.е. сохраняли свою

0-специфичность (испытаны шигеллезные и сальмонеллезные диагностикумы и экспериментальные эшерихиоэные диагностикумы, перекрестных реакций с нативными и гидролизованными ЛПС при этом не наблюдали). Таким образом, обработка щелочью приводит к раскрытию антигенных детерминант, распознаваемых антителами к гликолипиду.

В РПГА с гликолнпидным диагностикумом были испытаны также препараты

ЛПС, выделенные из различных штаммов сальмонелл, шигелл и кишечной палочки методом экстрации хлороформом и метанолом. Приведенные эксперименты показали, что эти препараты также приобретали способность тормозить

РПГА с гликолипидным диагностикумом лишь после щелочного гидролиэа.

В экспериментах были испытаны также эритроцитарные сальмонеллезные

"и шигеллезные диагностикумы экспериментальные эшерихиозные 0-диагно- . стикумы и сальмонеллезные, шигел-, лезные и эшерихиозные диагностикумы, сенсибилизированные препаратами ЛПС, полученными методом хлороформ-метанольной экстракции. В РТП1А с этими диагностикумамн были испытаны сенсйтины, использованные для получения диагностикумов. B этих экспериментах РПГА тормозили только гомологичные сенситины независимо от их обработки щелочью.

Таким образом, способность выявлять в РТПГА лнпополисахариды различных бактерий после их щелочного гидролиза обладает только гликолипыдный эритроцитарный диагностнкум.

1142122

Исследованные ЛПС

Минимальные ингибирующие дозы, мкг мл

После гидролиза

До гидро- Прогрев лиза без щелочи

0,1

0,1

Гликолипид

Шигеллы Зонне

1 фазы

> 2000

>2000

>2000 )2000

Шигеллы Зонне

2 фазы

Эшерихия коли 0127 >2000

Сальмонеллы тифимуриум

>2000

>2000

Сальмонеллы тифа

Составитель В.Дроздов

Редактор Н.Швыдкая Техред М.Пароцай Корректор Е.Сирохман

Заказ 591/6 Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений;и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, r.Óæãoðoä, ул.Проектная, 4

Эшерихия коли ОШ

Эшерихия коли 055

Эшерихия коли 01

Эшерихия коли 02

Эшерихия коли 020

>2000

>2000

>2000

>2000

)2000

>2000

>2000

>2000

>2000

>2000

>2000

>2000

>200.0