Способ получения фосфорибулокиназы

Способ получения фосфорибулокиназы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗЫ путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония , гель-фильтрации и ионообменной хроматографии , отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПжЛИК

4(59 С 12 N 900

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОсудАРстВенный комитет сссР

Ilo делАм изоБРетений и откРытий (21) 3571224/28-13 (22) 25.02.83 (46) 07.05.85. Бюл. № 17 (72) И. К. Хасанов, В. В. Иванищев, Ю. Д; Ахмедов и Ю. С. Насыров (71) Институт физиологии и биофизики растений АН Таджикской ССР (53) 577.15 (088.8) (56) 1. Racker Е. The reductive pentose

phosphate cycle. 1. phosphoribulokinaaa and

ribulose diphosphate сагЬоху1азе. — «Arch.

Biochem, Biophys.», 1957, 69, р. 300/310.

2. Slabas А. R., Walker D. А. Inhibition

of Spinach phosphoribulokinase by DZ-glijceralde hyde. — Biochem. J., 1976, 153, р. 613—

619., SU.„1154329 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФОСФОРИБУЛОКИНАЗЫ путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения выхода целевого продукта, используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды.

1154329

Изобретение относится к производству ферментов, а именно к технологии их получения и может быть использовано для получения ценного реагента — рибулозо-1,5-дифосфата и при создании искусственной системы для моделирования работы карбоксилирующей фазы фотосинтеза.

Известен способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината. Способ предусматривает гомогенизацию 8 кг листьев шпината, двукратное насыщение полученного сока сульфатом аммония (17 — 40 /p), двукратное осаждение охлаждаемым ацетоном (40 — 50 /p), снижением рН среды до

4,5, двукратным осаждением сульфатом аммония (35 — 55 /p) и вновь дробным осажде- 15 нием сульфатом аммония (25 — 45 /p) (1).

Однако этот способ предполагает использование значительного количества исходного материала (листьев шпината), больших объе мов гомогената (до 5 л) и многократное фрикционирование сульфатом аммония, что приводит к значительным потерям фермента в процессе очистки.

Известен также способ получения фосфорибулокиназы из листьев шпината путем их гомогенизации, насыщения сульфатом 2S аммония, гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Способ включает экстракцию листьев шпината в трис-НС1 буфере рН 8,1, двукратное насыщение сульфатом аммония (30 — 60 /p), экстрагирование ацетоном, охлажденным до -20 С (30 — 50/p), новое насыщение сульфатом аммония. до

55 /, гель-фильтрацию через сефадекс G—

200, насыщение сульфатом аммония до 75 /<, гель-фильтрацию через сефадекс G — 25, ионообменную хроматографию через диэтила ми ноэтил целл юлозу (2) .

Известные способы сложны и обеспечивают недостаточно высокий выход целевого и роду кта.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение выхода целевого про- 4П дукта.

Указанная цель достигается тем, что при способе получения фосфорибулокиназы путем гомогенизации листьев растений, насыщения сульфатом аммония, гель.-фильтрации 4> и ионообменной хроматографии используют листья русских бобов, а ионообменную хроматографию на диэтиламиноэтилцеллюлозе проводят дважды.

Пример. 400 г, свежесобранных листьев двухнедельных растений русских бобов промывают холодной водопроводной водой и спо ласкивают дистиллированной водой. Остатки воды удаляют с листьев фильтровальной бумагой. Затем в холодной комнате при 4 С листья измельчают в размельчителе тканей

PT — 1 в присутствии 400 мл трис-HCl буфера 0,05 М рН 8,0. Полученную суспензию фильтруют через четыре слоя марли. Этот гомогенат центрифугируют при 10 000 ., t = 0 С на центрифуге ЧАС-25. Супернатант насыщают сульфатом аммония до 30 /о и центрифугируют при тех же условиях. Оса док отбрасывают, а супернатант насыщают сульфатом аммония до 60 /р и вновь центрифугируют при тех же условиях. Полученный осадок растворяют в минимальном объеме (10 мл) того же буфера. Этот раствор наносят на колонку с сефадексом G-50. Размер колонки 2х30. см. Белок с колонки элюируют тем же буфером. Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5 X 14 см) . Затем через эту коленку пропускают 300 мл 0,05 М трис-НС1 буфера рН 8,0 с градиентом КС! 0,02 — 0,2 М.

Фракции, обладающие активностью фосфорибулокиназы, насыщают до 75 /р сульфатом аммония, затем центрифугируют. Осадок растворяют в минимальном объеме (5 мл) того же буфера и наносят на колонку с сефадексом G-25 (2 X 30 см). Собранный обессоленный белок наносят на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (2,5 X 14 см) и проводят ионообменную хроматографию, как описано, используя трис-НС! буфер 0 05 М рН 8,0 и градиент концентраций КС1 0,02—

0,2 М.

В таблице приводятся характеристики ферментов, выделенных по предлагаемому и известному способам.

Полученный препарат характеризуется однородностью при электрофорезе в 5, 7,5 и 10 /p-ных полиакриламидных гелях, имеет характерную молекулярную массу в

250 000 дальтон.

Предлагаемый способ позволяет повы сить выход. фосфорибулокиназы и сократить количество стадий выделения.

1154329

Способ

Показатели

Предлагаемый

Известный

Удельная активность фермента в листьях, нкат/мг общего белка

0,24

0,36

Количество очищенного фермента на 1 г листьев, мг

0,075

О, 012

Количество очищенного фермента на 1 г общего белка экстракта

О, 0071

0,0023

Электрофоретическая однородность

Удельная активность, нкат/мг,белка

56

Количество растительного материала для получения 1 мг очищенного фермента,г

83

Составитель Н. Гуляева

Техред И. Верес Корректор А. Зимокосов

Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

I l 3035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор О.Юрковецкая

Заказ 2633 24