Способ получения @ -лизина

Способ получения @ -лизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ-L-ЛИЗИНА, включаюп й глубинное культивирование продуцирук)П1их его микроорганизмов на питательной среде, содержащей исг точники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза лизина, питательную среду добавляют при оста (Я точном содержании треонина в среде 0,03-0,08 г/л.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (1) ) 4(sl) С 12 Р 13/08

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3599266/28-13 (22) 28 02 ° 83 (46) 23.05.85. Бюл. Ф 19 (72) А.М.Босенко, В.И.Огарков, В,Е.Матвеев, А.С.Юдин, А.В.Кузнецо, ва, Н.Н.Якимович, Е.И.Вальгер и Н.П.Богданов (71) Белорусский ордена Трудового

Красного Знамени технологический институт им. С.М.Кирова (53) 576.6(088.8) (56) 1. Способ подпитки в процессе ферментации при производстве лизина.

Проспект ВДНХ СССР Главмикробиопром.

ОНТИТЗИ вЂ” Микробиопром, 1981.

2. Авторское свидетельство СССР

В 498940, кл. А 23 К 1/00, 1973.

3. Авторское свидетельство СССР В 675980, кл. С 12 P 13/08, 1979. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ЛИЗИНА, включающий глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей ис-. точники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты, в условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения концентрации лизина в культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеза лизина, питательную среду добавляют при оста точном содержании треонина в среде

0,03-0,08 г/л.

1157059

Изобретение относится к микробиологической промьпипенности, в частности к получению незаменимой аминокислоты L-лизина, используемой и качестве добавки к кормам пля 5 животных и птицы.

Известны способы получения 1-лизина путем глубинного культинирования продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содер- 10 жащей источники углерода, минеральные соли и необходимые аминокислоты, при периодическом добавлении н процессе культивирования питательной среды, содержащей источники 15 треонина, метионина и других необходимых при биосинтезе лизина веществ с последующим выделением L-лизина из культаральной жидкости. Время начала добавления дополнительных пи- 20 гательных веществ (подпитки), необходимых для роста биомассы и биосинтеэа Е-лизина, определяют по отклонению от необХодимого уровня рН культуральной среды 13, концентра- 25 ции редуцирующих веществ f2) и ряду других показателей.

Однако эти способы не обеспечивают стабильность процесса биосинтеза L-лизина вследствие того, что указанные показатели не учитывают содержание компонентов, определяющих биосинтетическую активность лизина 9 ростовь.х аминокислот с

1 держание которых значительно колеблется в различных источниках сырья.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения L- лизина путем глубинного культивирования его продуцентов на питательной среде э 40 содержащей источники углерода, минеральные соли, ростовые аминокислоты

9 н условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды н процессе культивирования (стериль45 ных водных растворов мелассы и мочевины), причем раствор мелассы вносят при снижении PB в культуральной жидкости по 4,0 - 7,5 7 и раствор моченины — начиная с 24-го часа культивирования Г31.

Однако известный способ не обеспечивает стабильных показателей при биосинтезе L-лизина и они колеблются в широких пределах (уровень накоппения лизина 46-75 г/л в течение

72-96 ч). Это связано с тем, что ауксотрофные мутанты — продуценты лизина, лишь при наличии ростовых аминокислот в среде активно растут и при их утилизации рост культуры прекращается и начинается синтез лизина.

Е;сли в период прекращения роста культуры и начала активного синтеза внести в среду какой-либо источник ростовых аминокислот, то культура начнет перестраиваться на синтез биомассы, а это связано с торможением биосинтетических процессов. Таким образом, способ подачи н ферментационную среду, например, растнора мелассы, содержащей наряду с углеводами ростовые аминокислоты, при определенной концентрации н среде редупирующих веществ (углеводов) не обеспечивает стабильных показателей при биосинтеэе лизина.

Цель изобретения — повышение концентрации лизина н культуральной жидкости при одновременном сокращении продолжительности биосинтеэа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения

L-лизина, включающему глубинное культинировапие продуцирующих его микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода; минеральные соли, ростовые аминокислоты, н условиях аэрации при периодическом добавлении питательной среды в процессе культивирования с последующим выделением лизина иэ культуральной жидкости, питательную среду добавляют при остаточном содержании треонина н среде 0,03-0,08 г/л .

Активный синтез лизина начинается после утилизации значительной части ростовых аминокислот и, в частности, треонина. Причем максимальная скорость биосинтеза лизина достигается при сравнительно низкой удельной скорости роста культуры, которая зависит от остаточного содержания ростовых аминокислот и среде, В случае же полной утилизации ростовых аминокислот удельная скорость роста культуры приближается к нулю и скорость биосинтеза лизина при этом снижается. Максимальная скорость

I биосинтез лизина соответствует невысокой концентрации ростовых аминокислот и, в частности, треонина в пределах 0,03-0,08 г/л. Таким образом, начало внесения подпитки, содержащей наряду с угленоцами ростовые аминокислоты, обеспечивает высокие показатели при бпосинтеэе лиэи1157059 на. При известном же способе начало подачи подпитки в зависимости от концентрации углеводов s среде не представляется возможным по отмеченным причинам, Невозможно также получить стабильные показатели би6синте. 2S

0,08-0,12

0,8-1,0

При достижении уровня треонина ° в среде 30-80 мг/л начинают произвоза лизина.

Способ осуще.ствляется следующим обр азом.

Продуцирующие L-лизин гомосерин- tc зависящие микроорганизмы выращивают в лабораторных условиях в колбах на качалке, а затем в посевном ферментере емкостью 1 мз при непрерывной ч аэрации и перемешиванни при 30-32 С, 15 рН 7,0-7,4 в течение 14-24 ч с использованием питательной среды следующего состава, г/л:

Меласса (с концентрацией РВ 46-487) 80-100 2О

L- Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,14-0,18

L-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,04-0,06

NH4CI (источником является нейтролизат БВК) 8-9

1 1Н4Н7 Р04 0,04-0,06 Зо

Мел технический 8-10

Пропинол Б-400 О, 15-0,2

Для биосинтеза Z-лизина посевной материал с концентрацией биомассы

9- 11 г/л в.количестве О 4-0 5 м пе3 35 редают в ферментер емкостью 15 м и проводят ферментацию в аэробных условиях при расходе воздуха 0,7

1,2 м /мин на 1 мз среди при 3032 С, рН среды 7,2-7,6 на питательной среде следующего состава, г/л:

Меласса (по PB 46-487) 135-140

L- Треонин (источником является гидролизат

БВК и меласса) 0,26-0,32

1,-Метионин (источником является гидролизат БВК)

МН4 Н РО4

NH4Cl (источником является нейтроли50 зат БВК) 16-20

Мел технический 5-8

Пропинол Б-400 О, 15-0, 20

Начальный коэффициент заполнения ферментера 35-43Х.

0,045 дить подачу дополнительной питательной среды по 300-400 л через каждые

2-3 ч следующего состава, г/л:

Меласса (с концентрацией РВ 46-487) 500-600

L-Треонин (источником является меласса и гидролизат БВК) 0,20-0,22

1,-Метионин (источником является гидролизат БВК) 0,08-0, 12

NH4 H P04 0,8-1,0

NH

Пропинол Б-400 0,15-0,20

Подачу питательной среды заканчивают при коэффициенте заполнения ферментера 0,7-0,8.

В процессе подпитки концентрацию

PB в ферментационной среде поддерживают 3-5Х, а биомассы 18-22 г/л.

По окончании процесса ферментации культуральную жидкость стабилизируют, затем упаривают и высушивают до влажности 8-107.

Пример

Продуцент L-лизина Corynebacterium g1utamicum Т-3 выращивают сначала на агаризированной питательной среде, а затем в колбах (750 мл) на качалке (250 об/мин) при 30-32 С в

50 мл питательной среды следующего состава, г/л:

Меласса (с концентрацией РВ 46X) 8

L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15

L-Метионин (источником является гидролизат БВК) О, 045

НН4С1 (источником является чейтролизат

БВК) 8

NH4H

Мел технический 8

Пропинол Б-400 0,15

Затем выращивание 0,5 м посевного материала продолжают в посевном ферментере емкостью 1 м с использованием питательной среды следующего состава, г/л:

Меласса (с концентрацией PB 467) 8

L-Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,15

1;Метионин (источником является гпдролизат БВК) 1157059

135

NHgC1 (источником является нейтролизат

БВК) 8

m @rO+ 0,6

Мел технический 8

Пропинол Б-400 0,2

В процессе получения посевного материала в ферментере поддерживают расход воздуха 1 м /мин на 1 м среды, рН среды 7,0, температура сре- 10 ды 30 С. Полученный посевной материал с концентрацией биомассы 9 г/л в количестве 0,5 м передают в ферментер емкостью 15 м, в котором проводят основную ферментацию., 15

Исходный состав питательной среды в ферментере (с учетом компонентов посевного материала) следующий, г/л:

Меласса (с полдержа- 20 нием 46Х РВ)

?;Треонин (источником является гидролизат БВК и меласса) 0,28

L-Метионин (источни- 25 ком является гидролизат БВК) 0,09

ИН Н РОа 1

NH C1 (источником является нейтроли- 30 зат БВК) Мел .технический 5

Пропинол Б-400 0,2

Начальный коэффициент заполнения ферментера (с учетом посевного материала) 0,43Ж, В начале процесса ферментации поплерживают расход воздуха 0,7 и /мин на 1 и среды, рН среды 7,2, температура среды

30 С. По истечении 10 ч ферментации расход воздуха увеличивают до t,2 м /мин на 1 мэ среды и поддерживают рН 7,4.

После внесения посевного материаФ ла отбирают пробу из ферментера и определяют начальную концентрацию треонина методом газожидкостной хроматографии, которая равна

300 мг/л. По истечении 6 ч от начала культивирования определяют остаточное содержание треонина в культуральной жидкости, которое равно 150 мг/л. Затем по предварительно построенной табл. 1, отражающей потребление треонина продуцентом лизина в данных условиях культивирования, исходя из остаточного содержания треонина, определяют время, при котором остаточная концентрация треонина в ферментационной среде достигнет 0,06 г/л, Это время равно

9 ч.

1157059!

1 1

1 I

Ю

CV м л

I ь

4Э

0V л

Ю

«ф

0«I л

I

D ь

0Ч л ь! I д! л

Ю

I ь О л

С 4 м л ь

Ю О .СЧ л

1 1 ь

CV м

° \ ь

D О

<4

Ю ь О л ь

Ю

С 4 л

Ю ь

D л

Ю

Ю м ь л

I

1

D (4 м л

I ь О

04

Ю

< 3 л ь

1 ь

Ю

Ю

D ь

1 I ь. м ь

1 I

1

1

Ю

С 4 м л

Ю (D О

С 4

Ю

«

СЧ л

Ю

1 ь

Ю

С 4 ь ь

00 ь л ь

I 1 ь

D л ь

6

Ц

1

1 — — 4

Ю («4 м л

Ю1

D О

С л

D

0V л ь !

D О л

D

00 ь л

Ю

) ь м ь ь

1 м

I !

I ! —

1 I

1 I 1 о

О х

В х м

1-

Б

3 и

° л

Q) Ц

E w

Ю

С 4 м л ь

Ю О

С 4 л

Ю О л ь

D

СЧ л ь ь

Ю л

D .

I ..: ь у)

Ю » л

cQ х х х!

Ф и

Щ .О (U х

М

О о

Ю

4 м л ь

Ю О

С 4 л

Ю ь

СМ л ь

D

Ю л

Ю

Ю

Ю

Ю м

D л ь х

Ф х

Х 07

О а х а

И

tf

О а

1

Х л

ql х

I °

О (» х

Э

tf ю

Э Э

A A

v s

О х х

О х о х !»

О В х

Б

З и

v ф ,О

° л

Щ

Ю ь л

I I ь 3

С Ъ 0

Ю 0l

Ю Д

00

Ю л

1 I I

Ю с5

1

Р

1

Ь 04 О 00 О\ е ° «ч ч 1

0,21

К 67-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается

L-лизина на уровне 48 г/л, что со.ставляет 38,7Х от потребленного сахара.

9 115705

Через 9 ч после начала ферментации начинают подавать подпитку по

300 л через каждые 2 ч следующего состава, г/л:

Иеласса (с концентраS цией РВ 46%) 543

L-Треонин (источником является меласса и гидролизат

БВК) 10

L-Иетионин (источником является гидролизат БВК) 0,08

ХН Н Р04. 1

ИН С1 25 15

Пропинол Б-400 0,2

В процессе подпитки концентрацию

РВ в ферментационной среде поддерживают 3, 5%. Подача подпитки обеспечивает поддержание биомассы на уров- 2ц не 18 r/ë. При достижении коэффициента заполнения ферментера 0,7 подачу подпитки прекращают и в среду вносят 1 г тиамина и 0,5 г дистибиотина. К 55-му числу ферментации в 25 культуральной жидкости накапливается

L-лизина на уровне 48,5 г/л, что составляет 37,2Х от потребленного сахара. Культуральную жидкость стабилизируют добавлением соляной кисло-З0 ты до рН 4,5 и 0,2%-ным бисульфитом натрия, затем упаривают, смешивают и высушивают до влажности 8Х.

Пример 2. Посевной материал продуцента L-лизина Brevibacterium

flavum выращивают как в примере 1. . Биосинтез L-лизина проводят в условиях анапогичных примеру 1.

Концентрация L-треонина s ферментационной жидкости перед началом ферментации равна 0,28 г/л. Через

8 ч от начала ферментации остаточное содержание треонина в ферментационной жидкости достигает уровня

О, 14 г/л. По табл. 1 по известным концентрациям треонина 0,28 и

О, 10 г/л находят время, при котором концентрация треонина в ферментационной жидкости равна 0,08 г/л. это вре мя равно 11 ч от начала процесса

Ферментацчи. Через 11 ч начинают noS0 дачу подпитки состава, указанного в примере 1.

Таблица 2

Продолжительность операции биосинтеза

Операция

Концентрация лизина в культуральной жидкости в конце операции,г/л лизина, ч

Corynebacterium glutamicum

45 0

54

44,8

47,0

48,0

44,2

48,1

58

Среднее

46,2

Brevibacterium flavum Е-541

48,0

46,7

47,1

66

1.0

45,5

44,5

Пример 3. Выращивание посевного материала и биосинтез лизина проводят согласно примеру 1. При этом начальное содержание треонина в культуральной жидкости при биосинтезе лизина равно 0,32 г/л. После

6 ч ферментации содержание треонина равно 0,17 г/л. Согласно табл. 1 начало подачи подпитки проводят через 10 ч, когда остаточная концентрация треонина достигает 0,03 г/л.

К 56-му часу ферментации в культуральной жидкости накапливается

L-лизина на уровне 47 г/л, что составляет 35,7Х от потребленного сахара.

В табл. 2 представлены показатели при биосинтеэе лизина серии операций, проведенных согласно предлагаемому способу.!

57059!

1 1

Продолжение табл. 2

) г з

Среднее

46,7

Составитель О. Скородумова

Техред П.Микеш Корректор Г.Решетник

Редактор Н.Яцола

Заказ 3282/23 Тираж 525 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Из табл. 2 видно, что накопление лизина в культуральной жидкости происходит до концентрации 44,2—

48 г/л за время 53-58 ч продуцентом лизина Corinobacterium glutamicum

Т-3 и до концентрации 44,5-48,2 г/л за 64-68 ч продуцентом Вгеч Ъасйег um flavum Е-531. За время культивирования достигается высокий стабильный выход лизина по сравнению с известным способом, использование которого в промышленных условиях, например, на П!ебекинском биохимическом заводе, дает выход лизина 25-357.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет обеспечить вос производимость высоких показателей при биосинтезе лизина: концентрации лизина в культуральной жидкости

44,2-48, 1 г/л,при использовании культуры Т-3 и 44,5-48,5 г/л — для куль10 туры Е-531, время биосинтеза 55-58 ч для культуры Т-3 и 64-69 ч - для культуры Е-531.

По сравнению с базовым объектом, используемым на Ливанском .биохимическом заводе, выход лизина от потребленного сахара увеличился с 3234 до 35-38Х койцен .рации лизина в культуральной жидкости выросла от

37-39 до 44-48 гlл, время ферментации сократилось от 70-75 до 6469 ч прн использовании культуры Е-531.