Способ определения метаболитов в биологическом материале

Способ определения метаболитов в биологическом материале

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРШЛЕ путем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 им в присутствии никотинамидного кофермекта и ферментов лактатдетидрогеназы.при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении dl-кётоглутарата, о т л и ч а ю щи и с я тем, что ,с цёI лью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, -глицерофосфата , -оксибутирата, глутамата , оксалоацетата, ацетоацетата, н диоксиацетонфосфата, вносят часть I нейтрализованного экстракта в глицингидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4, К окисленный никотинамид адениндинуклеотид и определяет малат, лактат, -глицерофосфат,глутамат и -оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы , dl тлицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и 0-оксибутиратдегидрогеназы , а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буфер рН 7,6, содержащий 1, М восста (П новленный никoтинa шдaдeниндинyклeoТ ед , и определяют пируват, оксалоацетат , d- -кетоглутарат, диоксиацетонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы , глутакатдегидрогеназы, с --глиСП церофосфатдегидрогеназы и } -окси бутиратдегидрогеназы. NU ел со

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СООИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (!9) (!» .

w

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3584981/28-13 (22) 19.01 83 (46) 23.05.85. Бюл. И 19 (72) Ф.Н.Гильмиярова, В.И.Радомская и Л.Н.Виноградова (71} Куйбышевский медицинский инсти" тут им., Д.И.Ульянова (53} 581.13(088.8) (56) I. Von Korf H.N. Purity and

stability of pyruvate and А -ketoglutarate in: "Methods in Knzymology"

v. l3, Меч York - London, 1969, р. 519-524. (54}(57:) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЕТАБО-.

ЛИТОВ В БИОЛОГИЧЕСКОИ МАТЕРИАЛЕ пу- . тем фиксации ткани, осаждения белка хлорной кислотой и спектрофотометрирования при 340 нм в присутствии никотинамидного кофермента и ферментов лактатдегидрогеназы при определении пирувата и глутаматдегидрогеназы при определении сА "кетоглутарата, о т " л и ч а ю шийся тем, что с це.,лью дополнительного определения в одной пробе малата, лактата, К -глицерофосфата, р -оксибутирата, глута" мата, оксалоацетата, ацетоацетата, к диоксиацетонфосфата, вносят часть нейтрализованного экстракта в глицннгидразиновый буфер рН 9,5, содержащий 4,5 IO Y окисленный никотин амидадениндинуклеотид и определяют малат, лактат, d. -глицерофосфат,глутамат и Р -оксибутират при последовательном добавлении соответственно малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, oI. -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и Р -оксибутиратдегидрогеназы, а другую часть нейтрализованного экстракта вносят в триэтаноламинсолянокислый буфер рН 7,6, содержащий 1,4 10 И восста- р новленный никотинамидадениндинуклео- MФ тнд, и определяют пируват, оксалоацетат, d- -кетоглутарат, диоксиаце" тонфосфат и ацетоацетат при последовательном добавлении соответственно лактатдегидрогеназы малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы, d- -гли" церофосфатдегидрогенаэы и Р -оксибутиратдегидрогеназы.

1157459 да калия.

Определение содержания малата, лактата,; -глицерофосфата,глутамата 35 и Р -оксибутирата.

Состав реакционной .смеси:

Буфер глицнн гидраэинсульфатный, рН 9,5,глицин 0,5 М, 40 гидраэин-сульфат

0,4 11, мл 2,8

НАД 0.,9 мг/ил, мл О,!

Нейтрализованный экстракт, ил

Фермент, мкг

Общий объем смеси 3 мл.

Длина волны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакция начинается последовательным внесением 50 фермента! малатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы, сА -глицерофосфатдегидрогеназы, глутаматдегидрогенаэы, и !

" -оксибутиратдегидрогеназы. Учитывается прирост оптической плотности 55 с момента ннесения соответствующего фермента до прекращения прироста и стабилизации показателей: Е - Е, со-, 0,1 45

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в медицине для определения содержания метаболитов в биопсийном материале тканей при оперативных вмешательствах, а 5 также в условиях эксперимента на животных для характеристики специфики обмена каждой ткани в норме в качестве диагностических и прогностических тестов при патологических состояниях,10

Цель изобретения — дополнительное определение. н одной пробе малата, лактата, А -глицерофосфата, (> -оксибутирата, глутамата, оксалоацетата, ацетоацетата и диоксиацетонфосфата, 15

Пример. Биопсийный материал (например, печень) после взятия эали" вают жидким азотом, навеску в 200иг гоиогенизируют до получения однородной порошкообраэной массы, подливая жидкий азот. Порошок запивают 0,4мл

0 6 н. раствора HCl0, тщательно растирают при комнатной температуре и оставляют для экстракции на 20мин.

По истечении времени центрифугируют 25 при 600 д 15 мин. Кислый супернатант сливают, осадок денатуриэованногo бел— ка отбрасывают. По универсальному индикатору нейтрализуют 2 и, КОН

0,6 ил. Помещают в ледяную баню на

5 иин и центрифугируют при 600 д

5 мин для освобождения от гипахлоритяии;

К вЂ” коэффициент раз недения;

3 — объем реакционной сиеси;

6,22 — коэффициент микромолярной экстинции НАД. Н при 340 нм ! см /мкмоль) .

Приведенная формула является однотипной дпя расчета содержания определяемых метаболитов и коферментов в микромолях на 1 г ткани.

Определение мапата.

Вносят малатдегидрогенаэу

Еа 0,067

0„100

02

Е, 0,1 йЕ 0,0

С = 0,545

Определение лактата.

Вно сят лакт атде гидро ген азу

Ео 0,)15

0,145

0,170

0,195

0,260

0,300

0,320

0,340

0,370

0.415

Е 0,415

Е = Ов300 и

0 = 4,38.

Определение с! -глицерофосфата.

Вносят.1 †глицерофосфатдегидрогенаэу (!

Ео

0,320

0,340

0,352

0,370

0,375

0,382

0,385

0,385

0,065

Е

ЛЕ=

С = 1,013

Определение глутамата.

Вносят глутаматдегидрогеназу

Ео О, 395

0.415 ответствует содержанию малата в пробе;

Е -Е, лактата; Е, -Е, с . -глицерофосфата; Е - Е, " глутамата; E>-Ep

& -оксибутирата, Концентрация метабо.метов выражается в микромолях на r ткани, Расчет ведут по формуле

AE ° 3

6,22 K где Д Е вЂ” разница между конечной и начальной оптическими плотнос1157459

0,430

0,455

0,460

0,470

0,475

0,475

0,080

0,485

0,500

0,510

0,525

0,540

0i550

0,555

0,560

0,560

0,065

0,2

0,645

0,640

0,635

0,630

0,625

0,625

0,020

Е5

ДЕ=

С * 0,184.

ВНИИПИ Заказ 3361/43 Тираж 897 Подписное

Филиал ЛПП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4.

Е

ЛЕ

С 1,25

Определение -оксибутирата.

Вносят р -оксибутиратдегидрогена10 эу °

IV

Ео

Е 20

ДЕ

С = 1,013

Определение пирувата, оксалоацетата, А -кетоглутарата, . диоксиацетонфосфата и ацетоацетата.

Состав реакционной смеси;

Буфер триэтаноламин солянокислый 0,1И, рН 7,5, мл 2,7

НАДН 3 мг/мп, мл 0,1 30

Нейтрализованный экстракт., мл

Фермент, мкг

Общий объем смеси 3 мл.

Определение ведется при длине вол-З5 ны 340 нм, слепой опыт не содержит кофермента. Реакцию начинают внесением фермента для определения пирувата лактатдегидрогенаэы. Регистрируется Ео . Реакция учитывается до стаби- а0 лизации показателя оптической плотности в течение 3-5 мин, (Е ). После" довательным внесением малатдегидрогенаэы, глутаматдегидрогеназы,с -глицерофосфатдегидрогенаэы и Р -оксибу- g$ тиратдегидрогеназы регистрируется уменьшение оптической ппотности (Е, Е» Е и Е ) Ь Е соответствует содержанию в пробе оксалоацетата,< -кето глутарата, диоксиацетонфосфата,ацета- у ацетата.

Определение пирувата.

Вносят лактатдегидрогенаэу

Eî 0,740

0,735

0,730

0,723

0,718

0,712

Е 0,712

Е= 0,028

А

С 0,409.

Определение оксалоацетата.

Вносят малатдевндрогеназу

Еа 0,715

0,700

0,695

01690

Е 0,690

ДЕ= 0,025

С 0,366

Определение о -кетоглутарата.

Вносят глутаматдегидрогеназу

Ео 0,695

0,680

0,672

0,650

0,650

0,645

Е 0,645

Е= О ° 040

Ь

С 0,586

Определение диоксиацетонфосфата.

Вносят о — глицеоофосфатдегидрогеназу

Ео

Е

АЕ=

С 0,293

Определение ацетоацетата.

Вносят -оксибутиратдегидрогеназу

Е 0,630

0,625

0,620

0,617

0,617

0,013