Способ получения липосом

Способ получения липосом

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛ 1ЕНИЯ ЛИПОСОМ, включающий диспергирование инкапсулируемой жидкости в присутствии фосфо-иипидОБ и раствора поверхностноактивного вещества в вололераствори-мом органическом растворителе с помощью ультразвука и удаление растворителя , о т л и -I а ю щ и и с я . тем, что, с целью упрощения способа, после диспергирования к полученной смеси добавляют воду или водный раствор солей, эмульгируют перемешиванием и удаляют растворитель путем пропускания газй и отгонки или отгонки при пониже1И1ом давлении перед эмульгированием или после него. 2.Способ ио п.15 о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве нерастворимого в воде растворителя используют бензол, алкили газоапкилбензолы , а.пифатические зфиры, а.льдегиды, сложные эфиры, кетоны, свободн111е и галогенированные алифатические и циклоалифатические уг л е в од ород ы. 3,Способ по п. 1, о т л и ч а 10 щ и и с я тем, что в качестве липидов используют вещества из группы лецитина,фосфатшдил-этаноламина, лизолецитина. лизофосфат1вдил-этаноламина , фосфатидилсерина, фосфатидилинозитола , сфингомиэлина, кардиолипи1 а , фосфатной кислоты, цереброзида , стеариламина, дипальмитоилфосфатидилхолина или смеси одного фосфодипида, холестерола и токоферола , 4,Способ попЛ отлнчаю L4 и и с я тем, что в качестве раствора солей используют 0,15 М сл раствор хлорида натрия. 00 5.Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве инкапсо сулируемого вещества используют красители5 ароматические вещества, лекарственные средства, ферменты или полипеитиды.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧН:НИ

РЕСПУБЛИК

ОЛИОАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H ПАТЕНТУ неенаамев мю — а м «ае:

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР по делАУ изОБРетений и ОтнРытий

/ (21) 2649649/ 28-13 (22) 04.08.78 (31) 9616 (32) 05 ° 08.77 (33) Швейцария (46) 23.05,85. Бюл. Р 19 (72) Иттшетть Шнейдер (Швейцария) (71) Баттель 11емориал Институт (CUlA) (53) 615.4 1?.8(088.8) (56) Тугге11 D.А.еп а11. Ne ; Аяресts

of. 1iposomes. "Biochimica et Biophysica Acta . 457, 1976, р. 259-302

Патент ф1 Г Р 2532317, кл. Б 01 .Г 13/02, 1976. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧБПИЯ ПИПОСО11, вклцачающий диспергирование инкапсулируемой жидкости в присутствии фос— фоттттттттцотз тт раствора поверхностноактивного вещества в волонерастворимом оргатгическом растворителе с поттотяью ультразвука и удаление раствортттелл> о т л и ч а ю щ и и с л тем, что, с целью упрощения способа, после диспергирования к ттолученной смеси добавляют воду или водный раствор солей, эмульгируют перемептивакием и удаляют растворитель путем пропускания газа и отгонки или отгонки при пониженном давлении перед эмульгированием или после него.

„,sU„„д тдщдт А

q(gi) A 61 К 9/50//А 61 К 9! JO

CTIoco6 Но и ° 1, о т JI H ч а Io

Ъ шийся тем, что в качестве нерастворимого в воде растворителя используют бензол, алкил- и газоалкилбензолы, алифатические эфиры, альдегlU1bI сложные эфиры, кетоны, свободные и галогенированные алифатические и циклоалифатические углеводороды.

3. Способ IIo TI ° 1, о т л и ч а ттт шийся тем, что в качестве липидов используют вещества из группы лецитина,фосфатидил-этаноламина, лизолецитина. лизофосфатидил-этаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидипинозитола, сфингомиэлпна, кардиолипина, фосфатной кислоты, цереброзида, стеариламина, дипальмитоилфосфатидилхолина или смеси одного фосфолипида, холестерона и токоферола.

4. Способ по п.1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве раствора солей используют 0,15 M раствор хлорида натрия.

5, Способ поп.1, отлич аюшийся тем, что в качестве инкапсулируемого вещества используют красители, ароматические вещества, лекарственные средства, ферменты или полипептиды.

1158031!

i I! (. > « .!, ;(31? ук>т B кол?>ОидальнОм

Г«Е. (7. И Н ОРГаНИЧЕСКОМ РаетВОРИтЕ:т(,, р к т>(ем избитс к p ac TBopP HHo

;.-!?К> ест!(о-активного вещества.

3 7; -.;;. - аничес.кий раствор подаю>(:,;,p ci > к кс лбу, содержящуто 30 мл е .- одного Na(; 1 концентра3(ттт< :, с .::: C»ecь эмульстгфицируют

Г; ->мощью эмульсифицирую;с:-г. к си(-::; ки, к>рящяющейся с высокой и?Г !" (Г,,ос?те этои стадии смесь

25 г(о«; ":.,Р;?„-,ть дисперсию мелких ка >> я!:HНРского pacTBopHTeля I3

:::.>;: и фазе, 1 я?((дая капля в дисперсии Гл р?к... т с>писянные линос омные .(7>с-- -,>(с- с > в(->тпики; Haáf fòoê липидов. с -,. ->и;;,(о трубки поток воздуха (сода(с? г;3>("трь «олбьт и пропускают (е!» б!i!(! к О f;. J(ове»г?Х(>ocTH .!Mv!II>cHH

">и —:>P!:-(=:IH«>3at(Hfr пРи 30 С р смесь

"-3 0 з (<»>с я и ri хл аж

<>

ji!-. ? i r !> (>Hpeнса > с?рР i1pH ""1 О С р в ре

-i,, l:.. Р чег о пари конденсируются

?т-..;,—;. :. — г.-. 3ту операцито продолжатот, .-.> тЕХ ПОР, ПОКа НЕ ПРЕКРаГИтСЯ

>сот-:,(. (,,-.! (-(я (примерно 20-30 м"! I) . ! . с. Гс этой стадии в колбе ГстяетcR гри>мс.рно 20 мл прозрачного раствора (;(,:.-- -!»гй !>1аС (,) °

? .-Нг липосомного раствора подвергают х1>оматографировантп(7 на ко>(с>н,е„содержащей 2,5 г Сефадекса (>-50 (э>(тоектт: Ор 1 5 т"1 ВОдный

МяС»., 0„.05 М фосфатный буфер, рН 7, 5). 55

Пр;- ат .ялнзе (спектрометрическом) элюата у-тя;OBT(eHo, что только 20-257 первоначального инсулинового раствора

I(з; брете:ие относится к медицине, HI (c>tire; спссобу получения липс сом, I.,с (» >3<3обретР>сия — угтрощение спос ого я, П вЂ”;. м e p 1, В 10-милпилитроB óIe . i!p(i (ео>(уто колбу помещают 2 мл

;,fI;!.-> . .,:r. >>с го г(ростого эфира и 1 мл ц тк. n:;.!a:(я затем добавлятот 0,2 мл ин<.,. (;>ноного раствора 1 О мг/л B г; 7?н>?(-(.:"-Ном !!яСг . при рН 3, Затем 10 туда,-(обявлятот 150 мг дипальмитоил((>Осфя (т(дит!хОлина (гидрОфильно .:(т;(3(-фт- > -т(с Е СОЕДИНЕНИЕ) И ттрИ КОМ-.ят»ой температуре гомогенную смесь подвергя>с>т,>;ет>ствтио ультразвука в 15 т=-тР! и= мин с помощью генератора БР?(.У. .-;О," " (t oäeпь В- 12, 20 т(Гцр

150 Вт), Пс:(учают прозрачный растВГ, !, <.P, аЩИЙ ЛИПОСОМНЫЕ JIPPJ(IIIPCT

Пс> и; т:,"« -.; ИДГ МИКРОПУЗК(РЬКОВ ИНСУ- 26 л! "нег. и; !. я створа. Такие микропузырьизбег яет tilt(a!I(улирс.>3 Irirll, Ilooтому в б о.-, ы п.не тве c!3 :! у;е и ((ы; ттипоГ OMI (т. (С . В OP >! О>К((Е т .. !7 3>l Е Г

К i(ÃПО ii> 30BЯT> B IС t(<3>(!1Е К аК (>(!

ПС,.>к.»(Г> Н . >Г > ОС -, >(;< » ;(»-Ч<ЯС (СПример 2. !>oJ!! Ый ряетн< р

->>(и!!or!1> >коэидя. >ь 1 0 Г /:! т >ст>Р г>! ((!> t >>3 О, . 1 рacTB!?pe .к!яС f спедус и>: обр;::зом, Сме т 77> мг .>тец(гтиня,,t, 1 ..(: амипоглюкозидя»1(оrn ряc г т>оря и

3 мл диизопропиловогn:э:(t>f(pa (с дl3epf >в(7! Обрябот;<Р у(тт>", ряз» > «Г,;,(;3

rÑЧЕ-l,:, 3 Мнrt, 2(! Кl!t, 15(l, r) Прн охпяж,к !fir! нижс 30 С с ио." o":ò ю

n»! t >ждat >t ((т! б я(>и. !Оп чяк?т и;?О зря<>нук> Гемогеннук> г:.Нубонсl г rгю ?к!.;(Hn!- JI, :с котс>!>?й доб; в.(я>.т 5 >!;: О, 1 5 водного 7((<>СО . Смс с > эм ",ьс ис!?и(((т!? у>с>, кяк ni ис.янО в при?(((т?(> 1>, ис?Гие <(с. г(! тс?((тс?<13? м >и!>Гтпо Ilpnj 13яю7 г(отеком азота,, который нипяривяет ор."ян (чРс кий 1? яс ГБО(? итГ?гь, 0 т < ."((? Q>f !3 к ггрогтоижаот по тех пот? р ио я пе прекратится исгт(3!? ет(т(е (20- >(7 ми.r) „

Получают прозра(ную Гус. и .!lзтго ко:! поидяпьt»ix . I(r>(?!.Ом Il «с -г! с м О, 5 ?1

> ряс тт3 ор е 7(с> СО, с". (? J(e p?!;3;. и Г:((? >3 !, небо?!в((тес к От(ич(с т (30 >, r.;>I;l 1(! !? >I

Г незахваченного (Ii p(."-(еитя, В 3 явиГимос ти 0 "т ((яз !(a<((> ltHI> t От раствор можно иеио !изот>ят» сям ио

С РбЕ >It ff>O Г(ОС. е- О-.дс t(> liH Jl >! С С<3ЧС; (Иротзян((ой,амилгп(отсозт(д>тзг((няприМЕР, ПОСРЕДСтт>О i ГЕПт -Х!?С?К((3 с?! РЯ(ОК(т! ня Сефядексе) .

II p (т к e p 3 (i<?>3" op7-,- Гпо Об по примеру 1, но I!caî i!ü.- .I!?T н 1(a"

,еетве инкяпсул ipye rot растт,оря

0. 05 Ii:>o IIII>iff б гс(7(3Г?;(К((! —:> яст! ор (фосфятный б тфер 10 ммо:li» pt! 7, 2)

0 5 мг/мтт цитозинярябииози., 1исперр

;.Ир» >(7(>(ей! (!><>3 Ой 1 5 .,> !) > птгпидом — кя>?7ц(опfliiila (с-7 мг), органическим рас > пор;(телем — дибутипогп гй простой фир (=,Г> мл) ii С. Х,"» (0,6 ((.- ) .

Пример 4, Пс вторяют способ по гpHMep?> 1, Но с использованием следующих веществ: инкапсулируемый пеницилламин концентрации 100 мг/мп (О, 1 моль), дис —.».å ðãHpу(ощая среда водный 0,15 iI,Ìà(,(>, иоверхност. оактивное вещество — лецитин 105 мг, холестерин 3 5 мг, раствор i Te!i B бутилацетат 3 мл, Пример 5. Повторяют способ по примеру 1, но испочьзуют следующие ингредиенты: для инкяпсули1 I 5RI!31 роеэл пня — б»тлметлэон ко»»центрлц«»и

1 »1 МГ / Е) РОИНОМ jlHH RTpиЙфасфсIТс (0,05 мл), диспергирую!цля фаза вадньп! 0 15 !1 ИЯС(! Липид — лецитин

85 м» и (ЬОсфятиди!1-э тана)!ямке» 4 ) !1Г; растворитель 3-гептанон 3 мл.

Пример 6. ПовтopEII()T способ по llpmrppv 1, используя в качестве ингредие !ТпВ слее!у7()п!Ие Веп»ест»»л:

0,1 мл водногn рлст»эорл кислотного комплекса по:!иинозиновой — Iin!!HöHòèд»»лавой к!»С)!От (поли 7 ) — поли (c )

I(nHrIp! трлции 1 мг/мл — для инклпсулировлния; диспергируюп!Яя фаз 1

0 1 5 I I l )с1СС НОН(?p?:íocTHÎ-сзктиF! Fr«)P ве!а»ство — лецитин 60 мг, стелриллмин 20 мг и холестерин 15 мг, ряст»эоритель — смесь 1:1 по объему ,H1!:3 OIiP011HJ1OBnI lIPn» TOI (!)И!? с1 И бv! и)»Яцет ат 1 3 MJI °

?0

Пример 8, 1 г трипсинл в

30 мл 0, 1 Г! (pII 7 фосфатного Гуфе ра обрлбатыг»ают ультрл113уком в присутствии pile TBnpR 30 r:ôîñôRòèäHëHнозитола в 1 00 мл д»»прони?»ового простого эфира. Затем 7обяв!!яют 460 мл водногn О, 5%-НоВ0 РЯС и правс JIF»T

nMQJI bCH(t)FIrTHPOI3 RHHB, ТОНКУ«Ю )МУсЛ Ь

cHIo Выпаривают г, течение 3 ч при

15 С под даш! Ilri»M 10 Тпрр, получая

B результате прозрачный липосомный раствор ° Посрепством анасш!зя образца (хроматография Fi;1 Гефлдексе С-50?, II p и м е р 7. V 20 MJ! дииэапронилового простого эфира д(?бяв:!яю7

1, 5 г лецитина, О, 4 г фосфлт»»дплс(р-— инаа и О, 5 г холестериня, затем

25 раствор 1,8 мг актиномипина !7 i! 3 . »л (Ьосфлтного буфера (О, 1 Г1, pII 7) .

С м е с ь и Од в е p B Rr() 7 x«J1 b T p а з в у к о B 0 H О бработке е3 течение 5 мин, кяк 01»ксана

U llpHMcðå 1. 31тем лоб ав:!я»я и 100 мл

30 водного (Ь)ос(1)л»ного буфера (0,1 рН 7) и )Mó(7»,сифицировлш»е псуи!007в.пяют тяк )1(с, как 13 пример» 1. !!састанлвливяя эмульсифицир унией ?»еп»алки, колбу присо»диняют к вакуумной !

in 1)у!пк с H»RE)J!(rIH» по(. тепе ннс умень- 35 ецлют до 10 торр при одновременном с п(эддер)»(ан»!и температуры 20-22 С. ПосJrp пркм(?p .о 45 мкн IHJf 30!!poll!1!!(? В!»3! простой эфир полностью отгоняется, Остаточная смесь по;»у !ается г. Виде

«30

1p01р лч НОГО .(! i! (10, OMHOÃп pRC7 13 Ор 1 . IIn с!э (?ДС7 лом ? P 0M 1 Tn1 P л()ии 05P<111»R н 1

Се(Ьядексе найдено, что злхвлче! IÎ

88% Ер»ЗОНЯЧа)!E,!rom ЯКтИНО сящкня F? г Г T;1 i! n yt:! p i! n

В я н 1 i с о (т л в г» с«Р т и р им: p H n 8 5 ., и р и м е р 9. !с 3 м(1 дибуTI«!0 вс Гn просто гo Э<Ь»»ря добавляют О, 11)1

РR c TROP 1 3, 9-бис ли?»ети?)с?мино" фена-!nтr! онийх !Opi

0 001 Г! и 0 15 Г! (3ЯСР. 1» )5 мг «-»иПЯЛЫ«ИтоИЛ-ф(Сфят)!дн .ХОЛИНа. 3ятЕМ смесь подверг ают у:)ьтряз луковому

B0 ý ä ей(. Tȑ0 1(Як аписаHO в I!I?1»M »p P 1 ) и по. l?? ci «)T 1! I)01 р ачнl!й (э»р! янис!»с ккй ра«.т-!c» содер)клп;»ш микропуэыр),к»1 (..шпс. сом ныл пр еда!ест —.-.å нники) указ анного окрлпiåHíàго воднаг0 раствора, окруженные слоем диплльмитоил-фос.— флткдилхолинл. Органический pRC7 !-Ор после тогс центркфугируют в те и,ше

20 мин rip!1 8000С,. IIo оканчлнк 1 этой стлj»H!1 полу «я»с)т прn3pачную попер.-;нnст-н Уio ф Я !3 и 11 A I vrl P 0 3 P R ч 13 Ую Г О.п У б с 1() до-iH 7c фазу, со7ер?(я»цую м: кропуз»!1)ь— ки, эт? фл 3 у, и?1ею lvio к ансис Tpiilii!Ii? геля, r!Pp»»oc!17 в 10-мкл п»ме rpoB!:й резервуар, где pp пpppM»7!I»BIII«?T с лам(эп»1«ю »ц»)ятpля с 0,3 мп ?00 мг/?»л

p Rc ò11о» я, (?10-»е«р НО(ГООт)ioiiie «i!!p О: 1 ) с "Ipc!» Гl лpöl! Т» Hл и фОc(Üлтидилcсриc(Л Н .!Иб с.-,",;.»ОВО .; «!pnC та .1 g(I)i(ð Е т с > . ?(! c T (?! ?1 лс Г с даб ЯB!Ея OT .? iM..i

0 ", )3 "«;i«?I n с с-iB!gV;,(".CB 17 («.»с Гс.

1!(«двс ") B 7 т ИНТГ «»сквнаму .;pp е.-»с!пи Влн)пп ..-»яг»!1»т»:.ой м»п!а)»кой. Ч»р»з 1 О-1 5 I li»H !IOJ!k «i il!JT BOMOBC н!!l!й .1»розpR i ный ряс 130р с одер?кяепкй в сусп»1»зки

)п!п(?с-омы сс см»»пл!!!IHI?!ii абсглочк ?M!i, !!я;);:-".Ие»!! C Ji ni » -) -с.оЙ n " .n7 0 !(и C nc Tn! IT кз смеси . Г»-.!ецит» iiR !» фос?".TH.-!111»сэI? i1н-:1 л Pc . В!»Ут!)» ил»»й Г)i 0é соc:тo! IT

I»з гв! Iiл . м!» 1 011. l (1)0(«Ьл ТII!»Ii. 1хол»»1!R, 1: Р и м е Р 10, !1»пас ом»»ыс. НР»сц-ЕПС С ГВСНШ;КИ, Свс!ЕРж(3П»ИЕ ИНСУЛИН, !!с лу iRF" т так 3(е, как описана;э приме ре 1. Зятем вместо Helrocpe«7» TH»II»o— го эмул» сифи шрованкя органического раствора, садер)клпего микропузырьки в водном О, 9," .,-нам ",. астворе сс!ЯСс, органический раствор сначала конц»нтркру»от, подвергая пое!И)генному давлению (20 торр) при камн1тной температуре. После выпарива»шя оргR ническкх pRCTBnpHT 7»I3 на дне резервуараа получают маслянистьп. е олуr1pn1p а lнl!й слой, coc тая»ц1»Й из слил" цп»хся ?шкропv зь!рьков. Все э:0 добаВЛЯЮт В КОЛбУ С ? МЛ ВОДНОГО Р«1СТBÎð R О, 9%-!IO B O (с»а С(, H C П ОМОП»ЬЮ

Г1ЯГ Hi!Т НОЙ МЕЕП Ь7КИ ЭT?«« IRСЛЯШIСТ «70 фазу диспергкруют в водной среде, «5ап31 липосом, содержащих инсулин.

Составитель В, Брусиловская

Редактор В,Петраш Техред С. Легеза Корректор Е. Сир охман

Заказ 3396/57 Тирах(7?2 Подписное

ВПИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений H открытий

113035, Москва, И-35, Раушскяя наб,, д. 4/5 филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул, Проект«яя, 4

Этя масля«истая фаза постепенно исчезает и через 10-15 ми«получают прозрачный гомогенный раствор, содержащий в сусдензии нужные липосомы. После хроматографировяния этого раствора на Сефадексе 4В Pharmac ьа Бче(1еп) я«ялиз некапсулирован«ой фазы показывает, что 52% исходног0 инсулина эффективно инкапсулировяно в липосомах.

Пример 1 l. Смесь лецитина

40 г, дибутилового простого эфира

600 мл и водного 0,9%-ното раствора л!аС1, содержащего 10 г/л инсулина, 400 мл, гомогенизируют с помощью гомогенизятора fLNISONTC (Ultrason- es 1с!,Great Âl ьа1п) .Полу Is!ox став бильный молочнообрязный раствор который наливают E -литровую колбу, содержашую 2 л вод«ого 0,9%-«ого раствора fa!ACI - Затем с помощью эмульсифицирующей мешалки Ор1 аническую суспензию и водн чо среду эмульси фицируют вместе 15 мин. После этого органический растворитель удаляют продувкой воздуха, т.е. смесь циркулирует вниз в колонке противоположно л(13 он под«и IaI0 цеIioc.I воздуха. Пос те IIIIJA собирают, после «асыще«ия парями растворителя, в н ерх«eé части т(оленки, Таким образом получают гомоген«ый полупрозрач«ь(й раствор

Пример 12, Дибутиловый простой эфир Э мл. водный 9%-ный ря; твор iАС(, содержащий 10 Mr /Më «;ули га, 1 мл и лецитин 135 мг помещают В проч«ую 1 0 миллилитр оную

Йирексовую пробирку вместе с 2 г стеклянных J!(пи (oB диаметром 1 мм. Пробирку закрывяют, помещают на мешалку и трясут в течение 30 ми« со скоростью

100 об/мин. Таким образом получают довольно гомогенный молоч«ообраз«ый раствор, который выливают в

100-миллилитровую колбу, содержащую

30 мл водного 9%-ного раствора гйС .

3«тем органический растворитель выпаривают, как описано в примере 2, используя поток азота. После продувки в течение 20-30 мпн получают лиг идный раствор липосом, содержащих инкяпсулирова«ный инсулин,