Способ получения агглютинина

Способ получения агглютинина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮТИНИНА путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последуюш,ей очисткой фильтрацией через анионит и аффинный сорбент, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, очистку проводят в условиях вакуума , в качестве анионита используют Дауэкс-1, а в качестве аффинного сорбента - иммобилизованный овомукоид.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМЪ(СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3573544/28-13 (22) 06.04.83 (46) 15.06.85. Бюл. № 22 (72) В. М. Лахтин, В. В. Мосолов и . П. Маслова (71) Институт биохимии им. А. Н. Баха (53) 615.32 (088.8) (56) 1. Bouhard P., Morouh Y, Tihier R.

Privat J.-P. Мопядпу М. An improved

method for purification of wheat germ

agglutinin lectin. — «Biochemic», 1976, 58, 1247 †12 (прототип).

„„SU„„1161111 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АГГЛЮТИНИНА путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последующей очисткой фильтрацией через аниойит и аффинный сорбент, отличающийся тем, что, с цел ь ю иовы щения выхода целево ro продукта, очистку проводят в условиях вакуума, в качестве анионита используют

Дауэкс-l, а в качестве аффинного сорбента — иммобилизованный овомукоид.

1161111

Изобретение относится к биологии, в частности к получению биологически активного гликопротеида из зародышей пшеницы отходов мукомольного производства.

Сам целевой продукт может найти применение в научных исследованиях: в гематологии, иммунохимии, микробиологии и систе матике организмов, биохимии, физиологии и экологии, эмбриологии и гистохимии, онкологии и др. Перспективно применение агглютинина в медицине в качестве противосвертывающего средства и в конъюгированном с лекарствами виде, например при терапии опухолей, а также в качестве идентификатора патогенных микроорганизмов в свободном (окраска методом

«сэндвич») или флуоресцентно меченом виде.

Известен способ получения АЗП, предусматривающий экстракцию муки из обезжиренных зародышей в разбавленной соляной кислоте с антиоксидантом, доведенйе рН среды твердым Трисом до 8,6 и очистку агглютинина фильтрацией экстракта через амберлит IRA-400 с последующей хроматографией на р-аминофенил-1-тио-2-ацетамид-1,2-дидезокси-у-D-глюкоп иранозиде, иммобилизованном на ультрагеле А 4 (1j.

Однако этот способ не обеспечивает высокого выхода агглютинина (500 мг агглютинина из 1 кг необезжиренных зародышей пшеницы).

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения агглюти нина путем экстракции муки из зародышей пшеницы, разбавленной соляной кислотой с антиоксидантом, с последующей очисткой фильтрацией через анионит и аффинный сорбент очистку проводят в условиях вакуума, в качестве анионита используют

Дауэкс-l, а в качестве аффинного сорбента — иммобилизованный овомукоид.

Способ осуществляют следующим образом.

Свежие зародыши пшеницы обезжиривают петролейным эфиром или гексаном.

Затем обезжиренные зародыши измельчают в мельнице ударного типа и экстрагируют раствором соляной кислоты с антиоксидантом при постоянном перемешивании. Затем доводят рН смеси до 8,6 и центрифугируют. Недостаточную жидкость последовательно фильтруют в условиях вакуума через колонку с анионитом Дауэкс-1 и иммобилизованный на агарозе овомукоид. Связавшийся с иммобилизованным овомукоидом агглютинин отмывают от примесей и проводят снятие агглютинина с сорбента, диализ полученного раствора против дистиллированной воды и лиофилизацию раствора очищенного агглютинина.

Пример. Свежие зародыши пшеницы (полученные на 1 — 14-е сут после помола зерна с Раменского Мукомольного комбината

Московской области) сразу обезжиривали.

Для этого 1 кг сырья заливали 3 л петролейного эфира при комнатной температуре и 0 мин смесь перемешивали, после чего эфир удаляли с помощью вакуумного отсоса на воронке Бюхнера (вакуум создавался водоструйным отсосом и не превышал 1 атм). Обработку зародышей эфиром повторяли еще 2 раза, высушивали в воздушной струе в вытяжном шкафе, периодически перемешивая сырье.

Выход по весу составлял 90Я. Хранили при

4 С в герметическом сосуде.

Все последующие операци и выпол няли при 4 С. 100 г обезжиренных зародышей измельчали в мельнице ударного типа и добавляли при перемешивании к 600 мл

0,05 н. HCt с 1 мм метабисульфитом натрия Na,S

20 овомукоидом агглютинин отмывали от примесей последовательным пропусканием через сорбент по 250 мл следующих растворов:

0,05 М Трис-НС! буфер рН 8,6; 1 М Na Cl;

0,05 М Na -ацетатный буфер рН 4,4.

Оптическая плотность последних порций элюатов из сорбента не превышала при

280 нм 0,03 для каждого из промывных. растворов. Снятие аглютинина с сорбента проводили 0,05 н. НС1 рН 1 6 и контролировали спектрофотометрически. Раствор агглютинина нейтрализовали 1 М щелочью и диализовали ночь против дистиллированной воды (1:100, по объему). Выпавший

55 перемеши ванин кристаллическим измельченным Тряс- (оксиметил) -аминометаном до рН 8,6. После центрифугирования смеси при 5000)(g 60 мин надосадочную жидкость фильтровали через предварительно уравновешенную 0,05 М Трис-НС1 буфером рН 8,6 колонку с 300 г сильного анионита на стирольной основе со степенью анионита ных сшивок частиц 2, размером шариков

37 — 149 мкм с функциональными группами

CqHqCHzM+(СНз) з в ОН:форме (дауэкс-1, 100 — 400 меш. Серва). Фильтрование проводили на стеклянном фильтре М 2 с применением вакуума, создаваемого водоструйным отсосом. Фильтрат сразу пропускали через предва рительно уравновешенный

0,05 М Трис-НС1 буфером рН 8,6иммобиз5 лизованный на агарозе овомукоид из белка куриных яиц. Объем сорбента составлял

50 мл осевшего геля и содержал 55 мг активного по трипсину овомукоида (исходно для пришивания к этому количеству агарозы

40 50 мл с помощью Br Nактивирования брали 200 мг очигценного на три псине иммобилизованного овомукоида). Фильтрацию экстракта через иммобилизованный овомукоид осуществляли на стеклянном фильтре № 3 с помощью вакуумного от45 соса. Связавшийся с иммобилизованным

1! 61111

Выход целевого продукта из 1 кг сырья, мг

Время хранения обезжиренных зародышей пшеницы, сут

603(585)"

600(585)

600(583)"

598(583)»

60

360

720

Составитель Л. Артюшина

Техред И. Верес Корректор М. Самборская

Тираж 722 Подписное

ВНИИ ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )K — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Редактор Н. Швыдкая

Заказ 3879/9 балластный материал углеводного происхождения удаляли из диализа центрифугированием при 5000)(g 30 мин, а надосадочную жидкость с очищенным агглютинином лиофилизировали на сублимационной сушке

КС-30. Таким образом, из 100 г обезжиренных зародышей (т. е. из 117 г необезжиренных зародышей) получали 65 г гомогенного, не содержащего солей лиофилизированного порошка агглютинина, с выходом 585 мг агглютинина из 1 кг необезжиренных зародышей. Рассчитанное в растворе после иммобилизованного овомукоида содержание агглютинина по характерной для него оптической плотности при 280 нм равной 15 (1Я-ный раствор агглютинина) совпадало с весом лиофилизированного агглютинина.

Выход целевого продукта по предлагаемому способу составил 580 — 603 мг на 1 кг необезжиренных зародышей пшеницы, а по способу-прототипу — в среднем 500 мг на 1 кг необезжиренных зародышей. Таким образом, предложенный способ позволяет повысить выход агглютинина íà 10 — 4о о.

Кроме того, применение вакуума на стадиях.обезжиривания и фильтрации через последовательно соединенные колонки с сильным анионитом и афинным сорбентом позволяет сократить время осуществления способа с 50 (по прототипу) до 24 ч (по предлагаемому способу).

Кроме того, обезжиренные зародыши пшеницы могут храниться более 1 года без заметного снижения выхода целевого п роду к" а.

В таблице приведены данные влияния времени хранения зародышей пшеницы на выход1 целевого продукта (обезжириванне

5 проводили через 1 или 14 сут).

Обезжиривание через 14 сут.

25 Предлагаемый способ получения агглютинин а из зародышей пшеницы доста точ но прост, используются доступные сорбенты, а в кач ест ве источи и ка сырья — отходы мукомольного производства, что может способствовать созданию безотходной техноЗО логии в мукомольной промышленности.