Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

Способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе , обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т личающийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,75%-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (! 9) (I 1) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTGPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

lO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 3654129/28-13 (22) 15. 07.83 (46) 15.06.85. Бюл. Р 22 (72) В.I1. Грачев, A.Ã. Гутманис, H.À. Завальный, А.Х. Зицманис, H.Ê. Клявиньш и В.Д. Попова (53) 577.15 (088.8) (56) 1. .Патент Великобритании

Р 2059991,кл. С 12 P 5/02, 1981.

2. NiIsson K., ИовЬасЬ К. FEH9

Letters, 1980, v. 118, р. 145-150. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВЫХ ИИКРОНОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК, включающий получе4(5!1 С 12 N 5/00 С 12 N 11/00 ние желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения технологических характеристик целевого продукта, обработку гранул проводят 1,4-1,757-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раствора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

3 11615

Изобретение относится к биотехнологии, s частности к получению микроносителей для иммобилизации и вцращизания клеток, рост которых

:вазможен на поверхности носителя.

Использование микроносителей для культивирования позволяет выращивать значительные количества клеток в одном реакторе, уйеньшает трудоемкость процесса, позволяет достичь . 10 большей стерильности и тем самым открывает возможности использования методов выращивания клеток в промышленных масштабах.

Для культивирования клеток ис- 15 пользуются различные микроносители, в частности, на основе декстрана, модифицированного коллагеном f1) .

Недостатками микроносителя являются двустадийность его синтеза, 20 невозможность его использования для культивирования некоторых типов клеток, а также ухудшение его характеристик при повторном использовании. 2S

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому положительному эффекту являет- ся способ получения желатиновых микроносителей для культивирования клеток, включающий получение желатиновых гранул при диспергировании водного раствора желатина в неполярном органическом растворителе (хлороформ-толуол), обработку гранул диальдегидами (глутаровым альдегидом)з н их сепарирование.

Способ предусматривает раздельное проведение всех стадий, двухкратное сенарирование, использование высоких концентраций глутарового альдегида (2), 40

Недостатками способа являются его миогостадийность, сложность, большой расход глутарового альдегида и не. достатки целевого продукта (окрашишаннв геля прн микроскопнровании, неспецифическая сорбцня но свободным альдегидным группам).

Цель изобретения - упрощение процесса и улучшение технологических S0 характеристик целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получе.ния желатиновых микроносителей дпя . культивирования клеток, включающему И получение желатиновых гранул при ..диспергировании водного раствора .желатина в неполярном органическом

48 2 растворителе, обработку гранул диальдегидами и их сепарирование, обработку гранул проводят 1 41,75Х-ными растворами диальдегидов одновременно с диспергированием раст-, вора желатина, а перед сепарированием гранулы дополнительно обрабатывают восстанавливающими реагентами.

В качестве диальдегидов можно использовать глутаровый альдегид, диальдегид азелаиновой кислоты, глиоксаль, терефталевый диальдегнд.

Обработка протекает в среде различных неполярных органических растворителей (машинного, трансформаторного масла, изооктана, толуола, ксилола, бензола, хлороформа и др.) с последующим отмыванием реакционной среды и последующим фракционированием, выделяя частицы микроносителя с оптимальными размерами 100-250 мкм. В качестве восстанавливакяцих реагентов используются реагенты, восстанавливакиць.. C=N связи и альдегидные группы, например боргидриды щелочных ме- . таллов, перекись водорода, атомарный водород, дитионит (гидросульфит) натрия и др.

Использование предлагаемого choсоба обеспечивает упрощение процесса получения носителя: уменьшается стадийиость способа получения микроносителя (отпадает необходимость в стадиях выпаривания, повторного автоклавирования и приготовления трехкомпонентной смеси), упрощается сос- . тав реакционной среды (вместо трехкомпонентной смеси по известному способу в предлагаемом используется однокомпонентная система); уменьшается общая продолжительность проведения процесса, уменьшается расход поперечно сшивающего агента (вместо использования 20 мп 25Х-ного раствора глутарового альдегида на 1,5 г желатина по известному способу в предлагаемом способе на такое же количество желатина используется

3 мл 253-ного раствора глутарового альдегида), Использование нредпагаемого способа позволяет заметно улучшить также качество микроносителя: обработка восстанавливающим рвагентом позволяет обесцветить частицы носителя (тви самым улучшаются его технологические качества) и облегчает непрерывный анализ роста кле- .

161548 4 счете на сухое вещество) 10Х желатина.

Пример 2. 200 мл 25Х-кого раствора желатина, полученного прн

50 С, суспендируют в 1 л смеси„ сос« тоящей из трансформаторного масла и изооктана (1:1 по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к смеси

10 прибавляют 75 мл 25Х-ного раствора глутарового альдегида и перемешивают еще 20 мин. Затем микроноситель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают иэооктаном, горячей водой

15 в присутствии поверхностно-активных веществ.н еще горячей водой. Полу- . ченный носитель заливают 500 мл

10Х-ного раствора перекиси водорода и выдерживают 0,5 ч, затем фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц

100-250 мкм. Получают 260 r влажного микроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 18Х желатина.

П р .и м е р 3. 200 мл 20Х-ного раствора желатина, полученного при о

50 С,сусненднруют в 1 л ксилола и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, прибавляют 75 л 25Х-ного глутарового альдегида н перемешивают еще 5 мин, Иикроиоситель отфильтровывают на сите 100 мкм, промывают петролейным эфиром, горячей водой в присутствии поверхностно-активных ве30

П р и м .е р 1. 400 мл 15Х-ного . раствора желатина, полученного при

504С, суспендикуют в 2 л смеси, состоящей иэ машинного масла и нэооктана (1:1.по объему), и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин. Затем, . не останавливая мешалку, к смеси приливают 150 мл 25Х-ного раствора глутарового альдегида конечная

) концентрация 1,46Х и перемешивают еще 20 мин. После этого носитель отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают иэооктаном,горячей водой в присутствии поверхностно-активных SO веществ, горячей водой. Полученный микроноситель заливают 1 л 2Х-ного раствора боргидрида натрия и выдерживают 0 5 ч, затем фильтруют, промы. вают водой и фракцноннрувт, отбирая $5,,ра глиоксаля (конечная концентрафракцию с раэмерамн частиц 100250 мкм. Получают 540 г влажйого мнкроносителя, содержащего (в переМ Ю мерами частиц 100-250 мкм, Получают 200 г влажного мнкроносителя, содержащего (в пересчете на сухое вещество) 1ВХ желатина.

П .р н м е р 4. 200 ил 20Х-ного раствора желатина суспенднруют в

1 л ксилола и интенсивно перемеши-. вают в течение 3 мнн. Затем, не останавливая мешалку, к суспенэин прибавляют 50 мп 35Х- него раство« цня 1,4X) и нер мааквают еще 5 мнн.

Далее обрабатывают согласно примеру

2. Получают 195 r инкроносителя,соз 1 ток на микроносителях, обработка восстанавливающим реагентом позволяет удалить несвязанные альдегидные группы и тем самым увеличить специфичность взаимодействия носителя с клеткой использование условия получения микроносителя позволяет получить носитель, который стабилен не только при комнатной температуре (20-25 С), но и при более высоких температурах, что облегчает проведение различных операций (стерилизации, дальнейшего модифицирования) с ним.

Согласно предлагаемому способу получен микроноситель с плотностью и прозрачностью, близкой таковым у воды, значительной химической и механической стабильностью, с размерами частиц, обеспечивающими оптимальный рост клеток и шарообразной формой микросферы, обсспечивающей быстрое прикрепление клеток к поверхности мнкрокосителя и эффективный рост и распластывание клеток самого различного типа. Полученные микроносители не разрушаются обычными культуральныии средами .и поэтому они могут быть использованы многократно. Рост культур клеток на них можно осуществить как в статических условиях, так и суспензионным методом в динамических условиях, т.е. в условиях глубинного культивирования клеток. ществ и чистой горячей водой. Полу" ченный микроноснтель заливают 500 мл .

0,5Х-ного раствора гидросульфита натрия н выдерживают 1 ч, затеи фильтруют, промывают водой н фракционируют, отбирая фракцию с раз1161548 держащего 17% желатина (в пересчете на сухое вещества).

Пример 5. 200 мл 20% íîãî раствора желатина суспендируют в л смеси, состоящей из машинного 5 масла и изооктана (l:1 по объему),и интенсивно перемешивают при комнатной температуре в течение 3 мин.

Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 50 мл 40%-ного раствора терефтальевого диальдегида (конечная концентрация 1,6%) в диоксане и перемешивают еще

60 мин. Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз горячей водой.

Полученный материал запивают 500 мл

ВХ-ного раствора перекиси водорода и выдерживают 0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размерами частиц

100-250 мкм. Получают 180 r микроносителя, содержащего 17% желатина (в пересчете на сухое вещество) .

Пример 6. 300мл 20%ного желатина суспендируют в 1 л смеси, состоящей из машиннога масла и иэооктана (1:1 по объему), и интенсивна перемешивают при комнатной темперачуре в течение 3 мин. Затем, не останавливая мешалку, к суспензии прибавляют 80 мл 28%-ного раствора свежеприготовлелного диальдегида азелаиновай кислоты (конечная концентрация 1,75%) и перемешивают

20 мин. Полученные гранулы отфильтровывают на сите 100 мкм и промывают изооктаном, горячей водой в присутствии поверхностно-активных веществ и еще раз водой, Гранулы заливают 500 мп 8%-ного раствора перекиси водорода и выдерживают

0,5 ч, фильтруют, промывают водой и фракционируют, отбирая фракцию с размером частиц 100-250 мкм.

Получают 190 г микроносителя с содержанием 17Х желатина (в пересчете на сухое вещество).

Микранасители, полученные согласно примерам 1-6, содержат 10-18% желатина (в пересчете на сухое вещество) имеют сходные свойства и могут быть применены (для размножения клеток) с одинаковым успехом.

Выращивание различных типов клеток на предлагаемых микроносителях протекает следующим образом.

10 мл плотного осадка микроносителей (предварительно стерилиэованных автоклавированием), что обеспечивает культуральную поверхность около 2500 см, и 40.20 све6 жеизолированных клеток куриных эмбрионов 9-дневного возраста суспендируют в 100 мл питательной среды 199 с 0,15% гидролизата лактальбумина, 5Х телячьей сыворотки, 0,1% галактозы, 20 мм буфера HEPES (рН 7,4) и антибиотиками.

Культивирование проводят в сосуде объемом 250 мл с подвешенной мешалкой при 37 С. В первые сутки культивирования число оборотов мешалки составляет 10 об/мин, на вторые и третьи сутки- 20-30 об/мин и далее 50-60 об/мин. Через 48 ч культивирования заменяют 50-70% среды на свежую . Спустя 4-5 сут после начала культивирования на частицах микроносителей формируются плотные культуры клеток куриных эмбрионов.

Концентрация клеток к этому времени достигает (2,6+10,3) млн. кл/мл, т.е. за 4-5 сут их число возрастает в среднем в 6,5 раза.

Клетки почек зеленых мартышек (КПЗМ) первого субпассажа культивируют на микроносителях в условиях, аналогичных описанным в примере 1, с той разницей, что посевная концентрация клеток в данном примере сос6 тавляет 1, 5 ° 10 кл/мл, концентрация сыворотки 10%.

Через 4-5 сут культивирования концентрация клеток достигает (1,5 0,22) млн. кл/мл, возрастая в среднем в 10,8 раза.

Клетки диплоидной линии М-?1 эмбриона человека, взятые на уровне

24 и 28 пассажей, выращивают на микроносителях, как описано выше, с той разницей, что вместо среды

199 используют основную среду Игла.

Через 5 сут культивирования число клеток увеличивается в среднем в

7,6 раза, концентрация клеток при этом достигает (1,14 0,11) млн кл/мл.

Таким образом, преимущества при использовании предлагаемого способа заключаются в том, что он проще известного в осуществлении: меньше стадий, однокомпонентная система, Составитель В. Муронец

Техред А.Бабинец Корректор A. Зимокосов

Редактор Н. Киштулинец

Тираж 525 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 13035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Заказ 3938!31

Филиал ППП "Патент", r..Óæãîðîä, ул, Проектная,4 уменьшена продолжительность, процесса;позволяет экомить сырье (уменьшен расход глутарового альдегида); улучшить качество целевого продукта так как полученный микроноситель стабилен в широком диапазоне температур (до 120 С), не содержит сво1161548 8 бодных альдегидных групп) которые обуславливаот неспецифическув адсорбцию компонентов среды), прозрачен (что позволяет проводить визуаль5 ный контроль культур клеток на иикроносителях); может быть использован для выращивания клеток многократно.