Способ хранения биологических проб животного происхождения для определения глутатиона

Способ хранения биологических проб животного происхождения для определения глутатиона

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОВДЕНИЯ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА путем предварительного обезбелачивания пробы сульфосалициловой кислотой, отличающийся тем, что, с целью увеличения сроков хранения, в обезбелаченную пробу добавляют .0,651 ,0 кратный объем 510 М раствора хлористой ртути с последующим доведением рН реакционной смеси до 2,5- 6,0.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (11) (5!)4 G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21j 3591357/28-13 (22) 08.02.83 (46) 23.07.85. Бюл. Р 27 (72) M.À. Иехтиев, Е.Г. Гаузер, Б.Ф. Керимов и Е.В. Драгунова (71) Институт физиологии им.А.И.Караева (53) 6 12.115(088.8) (56) Anafyt, Biochem. 1968, 25, р. 192-205., (54)(57) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛУТАТИОНА путем предварительного обезбелачивания пробы сульфосалициловой кислотой, отличающийся тем, что, с целью увеличения сроков хранения, в обезбелаченную пробу добавляют 0,651,0 кратный объем 5 ° 10 М раствора хлористой ртути с последующим доведением рН реакционной смеси до 2,56,0.

1168861

Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано при диагностических исследованиях.

Целью изобретения является уве- 5 личение сроков хранения.

Пример 1. К О, 1 мл цельной гепаринезированной крови крысы добавляют 0,6 мл 10Х-ного раствора сульфосалициловой кислоты (1:6).

Смесь перемешивают и после 10-минутного стояния центрифугируют при

5000 об/мин в течение 10 мин. Объем надосадочной жидкости считается равным сумме объемов соответствующих

Ъ компонентов (0,7 мл). К нему добавляют равный объем (0,7 мл) 5 10 Ъ раствора Н8СХ и затем устанавливают рН реакционной смеси до 4,0 0,1 н раствором NaOH или Ca(OH)> .. Пробу 2О хранят в плотно закрытом флаконе

60 дней. Избыток HgCfz не вошедшего с глутатионом в реакцию, определяют обратным амперометрическим титрованием 1 10 М раствором цистеина.

По разности между внесенным количеством НяСР и оттитрованным в конце определения находят содержание глутатиона в пересчете на 100 мл цельной крови по формуле 30

1o0 (v -v )

Va где Q — - содержание глутатиона на

100 мл цельной крови, мкмоль, V . - объем 5 ° 10 М раствора Н8СР, З5

-4 предварительно добавленного к цельной крови, мл

Ч вЂ” объем 5 10 М раствора НяСР, непрореагировавшего в реак- 40 ционной смеси, определяемый графическим путем, мл,"

V — объем цельной крови, взятой для анализа;

500 Mr ткани почки крысы гомогени-4 зируют с 4 мп 10Х-ного раствора сульфосалициловой кислоты (1:8). Смесь перемешивают при 5000 об/мин в течение 10 мин. Объем надосадочной жидкости равен сумме объемов соответствующих компонентов (500 мг = 0,5 мл, V=0, 5 мл+4,0 мл=4, 5 мл), к нему добавля-, ют 3,5 мп 5 ° 10 М НяСР и затем устанавливают рП реакционной смеси до 4,0

О, 1 н раствором NaOH или Ca(OH)>..

Пробу хранят в плотно закрытом флаконе 60 дней. Затем избыток ионов

Hg не вошедших в реакцию с глута21 тионом,. определяют обратным амперо-э метрическим титрованием 1 10 М раствором цистеина.

По разности между внесенным количеством HgCI> и оттитрованным в конце определения находят содержание глутатиона в пересчете на 100 г ткани по формуле

100 (Ч, -Ч,)

У

ga где 0 — содержание глутатиона на

100 г ткани, мкмоль, V — объем 5 ° 10 M раствора HgCE предварительно добавленного к гомогенату тканей, мл, Ч вЂ” объем 5 10 М раствора HgCZ непрореагировавшего в реакционной смеси, определяемый графическим путем, мл, ,„ — вес навески тканей.

Испытуют содержание глутатиона в разных пробах животного происхождения и при других сроках хранения.

Влияние сроков хранения пробы на определяемость глутатиона (М + m) представлены в табл. 1.

Как явствует из данных, химическая обработка биологических проб животного происхождения раствором

HgCI позволяет хранить их с перво2 начальным уровнем глутатиона в течение 100 дней.

Пример 2. К 0,1 мл цельной гепаринезированной крови крысы добавляют 0,8 мл tOX-ного раствора сульфосалициловой кислоты. После перемешивания и 10-минутного стояния смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течени 10 мин. К ней добавляют 0,6 мп

5 ° 10 M раствора HgCI<, устанавливают О, 1 н раствором NaOH рН реакционной смеси 4,5. Пробу хранят в плотно закрытом флаконе 180 дней. Содержание глутатиона в пробе находят так как описано в примере 1. Выбор оптимальных соотношений между объемом надосадочной жидкости и раствором

5 ° 10 М HgCX (М + m) представлен в табл. 2. Полученные результаты свидетельствуют о том, что при химической обработке надосадочной жидкости 0,65-1,0 кратными объемами

5 104М раствора HgCE данные о содержании глутатиона во время хранения проб (180 дней) статистически

1168 недостоверно отличаются от данных до хранения пробы, что является оптимальным интервалом соотношений объема надосадочной жидкости и HgCE

g (V„ ñ. ли4 V HgCE = 1: (0,65-1,0) .

Пример 3. 100мгткани печени крысы гомогенизируют при о

0-4 С с 1 мл 10Х-ного раствора сульфосалициловой кислоты при 800 об/мин в течение 1 5 мин. После 10-минут- 10 ного стояния суспензию центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин.

В надосадочную жидкость добавляют равный объем 5 1б М раствор Н8СЮ и 0,1 раствором БаОН или К0Н, или .15

Ca(OH) устанавливают рН реакционной смеси 1,5; 2,0 2,4 2,5; 3,5, 4,5; 6,0; 6,2; 7,0; 8,0; 10,0. Смесь хранят в плотно закрытом флаконе 180

861 4 дней и затем определяют содержание глутатиона как описано в примере 1.

Во всех исследованных тканях крыс (печень, почки, легкие, мозг, надпочечник) при рН меньш . 2,5 получаются заниженные, а при рН больше

6,0 - завышенное дбдержание глутатиона по отношени1о к данным полу-!

Ф ченным до хранения пробы. В интервале рН 2,5-6,0 найденные данные о содержании глутатиона в тканях крыс при хранении пробы до 180 дней недостоверно отличаются (р > 0,05) от данных по содержанию в тканях крыс до хранения пробы. Этот интервал рН (2,5-6,0) является оптимальным в предлагаемом способе хранения биологических проб животного происхождения для определения глутатиона.

1 ф 1 х I л

СЧ. м (М л

Ф.

+I

00 ь л

Г

+1

СЧ

° 0

lO

О

Р (ь

+I ь

0О л

+I

М

0 л

О1

+1

01

0О л О +! О

+1 ь

I

I ь

М л О

+I

С4 О

00 л л

+1 О

Ф

М ь О б

+1 ь

1 — -4

1 ь

1 М

C) л ь л.,О р, О) О\ л

+I

LCl и

С 4 О л

+1 О

01 л

Ф О

М

+!

00 Г л ь

+1

М О л О

+t ь

0О О л

О\

+! ь

4 (4 л л

CV м

Ch ь о 1

°

1

У

I

1

1 O (ч

О л

+! О

С 4

С 4

Ch

+( ь

0О л

+1 О

С 4

С 4 л

+!

0О

О

1

СЧ л

+( (с

t(;

С3 О

+( ь

СЧ

° °

04 л л

+! б

М

С4

М л

+1 О

С4

00 х

I Х

I Ою

04 х

Х

Г.ю

04

Ю и

О

Е л х х х х

0(С4

Х

1 1

I

1 (o

00 1 ь

СЧ ч»

1

i

1 О л

+(01

1 л (+!

Б Ф О л

СЧ

+(0О ( 0

С 4 л

М

+I л 0

«

1168861

СО л

+( О

СЧ

«-( О

00 ь л

0 00 .1-1 ь

С 4 1 !

С

+1

СЧ 1 ь л н а

С 1

СО л г

+1

О1

00 л г», 0O Ch ч:)

+I I л

1 л С(«

+1

М

1 l О л О\

М)

О х и

О

Е х и х

О

О

О х

"х (х Х

Ц(Гч Ф

1168846

Линейные индексы удерживания (3) Кислоты о виде соответствующих эфиров

Известный способ

72,9+3,40

17,6+1,50 б,б

4,7

63,22+1,5 В:л

2,8

8,5 Средняя погрешность измерений

11,2

7,5

С1,(54,47+3,60

Продолжение табл.4

Предлагаемый способ сч I

1 р! 1

1 1!

1 л

I o л № л

CO

Ch м.ф

М м с 3 сч

О

+1 и

Ц цо 1 !

1 ! м с"1

Ю

° е е.ф м л м

+! 3

CO м

Ф с»4 е о

Ф!

»Ф л

3!В О

+!

К) с 3

+сч О

+I

О

Ю

Ф л

О

+l

О сч 1е л м

Ch з!» л м

О о м е1е

chI

ФЧ л м

+I!

С4

Ch л

° \

CO

A л

+1

О

+I м л

+(IA

О

CV м

Ю

+1 м сч О

Ф О

+!

С4

Ф

Ch л

Ю +1 м л

+I л

Ф л о1

Ф л со

+! О сч ъ!е с 3

° \

CO

Ф

Ю

Ю еО

Н м

»

Ф с л

+! сс

Зф о в

+! с»!

4 сО

° ь сO

+1 л

4 л с0

+I еО еО

Г ь

Ъе

ЪФ сГ) л

° е

+I м

00 №

О

° ь лъ

+! ь еО (Ю

° ь л

° е

CV

Ю о

+1

Щ ь с»! ж ф

С4 х о с . О

Ю л»

+1 м сч л л

+1 со

1, i1

1 с4 г

Ф ф

О фьС ее и ж

o1o ф a ! 1

Q ее ф »в

X Ф ! о (I I ! Ю

>Ж 1 о1I

Р1- — -1

2! !!О

О I O

g I O

1 сс!

X I

Ф I I

Р I I

lo I м 1 о

I 1

Ф I o 1

1 - I

Ж l

Е» 1 о I л о ! Ю

° е

» г — — (!

X I

Э I

1168861

I х о с»

Ц о

I" ° ф о о щ

Ю.О" 5

Ю 6 е а

:о

9 l Ill

i I»

v о I с о сф ° a Q р оа цЙо

a ) 5

1168846