Способ определения концентрации аминофосфолипидов

Способ определения концентрации аминофосфолипидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АМИНОФОСФОЛИПВДОВ путем выделения фракции липидов из биологической ткани, растворения их в органическом растворителе, добавления нингидрина, инкубации реакционной смеси с последующим фотоколориметрированием водной фазы, отличающийся :тем, что, с целью повьпнения точности способа, липиды растворяют в четыреххлористом углероде, нингидрин добавляют в конечной концентрации 610 МГ/Ш1, в реакционную смесь дополнительно вводят 1 М хлористый кальций при соотношении хлористого кальция и реакционной смеси 1:1 с послес ю дующим отделением водной фазы. (Л с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (!9) (I() (5() G Ol N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

tlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2I) 3513671/28-13 (22) 16.09.82. (46) 15.08.85. Бюл. УЗО (72) .М.А. Царцидзе, М.В. Гордезиани, М.Г, Гегечкори, М.П. Мардалеишвили, О.С. Джишкариани и Б.А. Ломсадзе (71) Тбилисский ордена Трудового Крас.ного Знамени государственный университет (53) 612. 115(088.8) (56) Кейтс М, Техника липидологии, М., "Мир", 1975, с. 3-125 ° (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ АМИНОФОСФОЛИПИДОВ путем выделеиия фракции липидов из биологической ткани, растворения их в органическом,. растворителе, добавления нингидрина, инкубации реакционной смеси с последующим фотоколориметрированием водной фазы, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, липиды растворяют в четыреххлористом углероде, нипгидрин добавляют в конечной концентрации 6-!

О мг/мл, в реакционную смесь дополнительно вводят 1 М хлористый кальций при соотношении хлористого кальция и реакционной смеси I:1 с последующим отделением водной фазы.

Лродолиеиие табл.l

1 1 7 33 1 5

Определение концентрации аминофосфолипидов (предлагаемый) 3,8

63,2

Таблица 2

Конечная

Ошибка опыта, Е

Полученное количество концентрация нингидрина, мкг липида, мкг

61,6

5,3

6,0

63,2

3,8

8,0

10,0

62,1

4,5

Таблица 3

Молярность

СаС1 липида, мкг

0,5

22,5

50, 2.

63,2

1,0

3,8

63,2

1,5

3,8

Таблица 4

Соотношение

IМ СаС1 и раствора липида

Полученное количество

Ошибка опыта, 7 липида, мкг

3,8

3,8

6,1

1:0,9

1:1

1:1р!

63,2

63,2

61,0

Определение с помощью .нингидринового реактива (известный) 60,26

7,4

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано при биохимиче ском анализе фо сфолипидов в биологической ткани .

Целью изобретения является повыше - 5, ние точности способа, Пример, Липиды из биологической ткани экстра гируют 20-кратным объемом смеси хлороформ — метанол и ри соотношении 2 : l, дв а раза смесью при соотношении 1 : I и затем о садо к заливают этой же смесью (l : I ) и оставляют на ночь . На следующий день экстр акцию липидов проводят дважды смесью хлороформ — метанол 1 5 при соотношении 2 : Объединенные липидные экстракты отмывают о т водора тв оримых примесей охлажденным раствором 0, 3 N NaC1, добавляемым с таким расчетом, чтобы верхний 20 водный слой содержал не более 50 Х спирта (во избежание извлечения фосфолипидов), После центрифугиров ания верхний водора ств оримый слой отсасывают . Пленку, образующуюс я 25 на поверхности раздет а двух фаз

1 хлороформенной и водно-спиртовой), растворяют добавлением небольшого количества этилового спирта, Хлороформенный экстракт, содержащий фо с- -30 фолипиды, упаривают под вакуумом досуха при комнатной температуре .

Общее количество липидов определяют весовым методом, сухой остаток растворяют в органическом рас тв о35 рителе — четыреххлористом углероде (СС14) из расчета раствора на 1-3 мг липидов

Процесс выделения липидов и определения в них концентрации аминофос- 40

° Ф фолипидов проводят при стандартных условиях (комнатная температура

18-20 С, давление 760 мм рт.ст.)

; в течение 40-50 мин.

1 Таблица 1

Полученное Ошибка количество опыта, 7.

К фосфолипидам, растворенным в

4 мл СС1, дббавляют нингидрин в конечной концентрации 8 мт /мл липидного раствора. Инкубацию проводят при 60 С в течение 10 мин. Раствор

О фильтруют. Для извлечения из СС1, образовавшегося розоватого комплекса добавляют 4 мл водного раствора 1М СаС! . Смесь взбалтывают и оставляют до полного разделения водной и органической фаз в течение 30 мин.

Измеряют интенсивность поглощения перешедшего в водную фазу комплекса при длине волны 403 нм и определяют

3 11 количество аминофосфолипидов по стандартной кривой. Стандартная кривая строится по известным концентрациям фосфатидилзтаноламина.

В табл. 1 приведены данные опреде ления заданного 1например, 65 мкг) количества аминофосфолипидов — фосфатидилэтаноламина известным и предла\ гаемым способами.

В табл. 2, 3 и 4 приведены данные определения заданного (например, 73315 Д

65 мкг) количества фосфатидилэтанолампна при различных значениях концентраций нингидрина и при извлечении комплекса при различных значениях молярности и объема CaCI> соответственно.

Как видно из таблиц, использование способа позволяет повысить точность

10 определения концентрации аминофосфолипидов.

Составитель Е. Житпикова

Редактор Л. Веселовская Техред Л.Иикеш Корректор В. Гирпяк

Заказ 5044/43 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушскал наб,, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4