Способ подготовки препаратов бактериальных клеток к электронно-микроскопическому исследованию

Способ подготовки препаратов бактериальных клеток к электронно-микроскопическому исследованию

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ путем пропитывания образцов, замораживания , скальшания и репликации сколотых поверхностей, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, с целью предупреждения изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов, пропитывание проводят в 1%-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5-10 мин, а замораживание и скалывание ведут при температуре от -150 до . О)

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPGHOIVIY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4ь

Crl

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3481557/28-13 (22) 11. 08. 82 (46) 23.08.85. Бюл. У 31 (72) В.Н. Герасимов и А.Н. Камынин (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (53) 616 (088. 8) (56) Rytev А.К. et al,Etude an microscope electronigue de plasmas contenant de е acide de soxikitonueleigue. Z. Natuzfozch., v. 138, 1958, 597.

Moor Н. Fine structure in frozenetched Seast celes. Sourhol С.M. Biologica, 1963, 17. 609.

„„SU„„1174380 А (51)4 G 01 N 1 28, А 61 В 10/00 (54)(57) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРЕПАРАТОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК К ЭЛЕКТРОННО-МИКРОСКОПИЧЕСКОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ путем пропитывания образцов, замораживания, скалывания и репликации ско лотых поверхностей, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью предупреждения изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов, пропитывание проводят в 1Х-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5-10 мин, а замораживание и скалывание ведут при температуре от — 150 до -170 С.

1174380 2

Изобретение относится к микробиологии, в частности к исследованию водорастворимых биопрепаратов в обезвоженном состоянии электронной микроскопией, и может быть использовано для ультраструктурного ана" лиза высушенных и лиофилиэированных тканей и клеток, бактерий и бактериальных вакцин, вирусов и вирусных вакцин в обезвоженном состоянии 10 (в анабиозе).

Цель изобретения — предупреждение изменений ультраструктуры сухих водорастворимых препаратов.

Способ осуществляют следующим образом.

Препарат бактериальной клетки пропитывают в I -ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 510 мин, полученную суспензию наносят на плашку и замораживают в жидком фреоне-22, охлажденном жидким азо, том, в течение 5 с, затем препарат переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженный препарат скалывают на охлажденном столике при температуре от †1 до -170 С в вакуумно-эамара— 6 живающей установке (2х10 torr) .

На сколотуюповерхность образцана- 30 пыляют платину из катодной пушки в течение 8 с, и укрепляют углеродом в течение 15 с, Реплику снимают с поверхности образца в 40%-ном водном растворе хромовой кислоты в течение

24 ч. Затем реплику промывают дважды в бидистиллированной воде по

20 мин каждый раз. Далее реплики монтируют на медные электронномикроскопические сеточки и изучают их в элек-40 тронном микроскопе.

В таблице представлены результаты криофрактографического анализа сухих водорастворимых биопрепаратов, препарированных по данному способу, 45

Плоскость скола проходит через частицы биопрепарата или их естественные поверхности..Биопрепарат состоит иэ частиц округлой или овальной форы, отдельные частицы биопрепарата(при- 50 мерно )O ) имеют диаметр 13,0-20,0 мкм, В частицах биопрепарата выявляют клетки биоагента„ равномерно распреде« ленные в защитной среде. На таких

l сколах также можно исследовать ульт- S$ раструктурную топографию бактериальных клеток в биопрепарате. Клетки сжаты и имеют длину 1,1-1,5 мкм, ширина .О, 15-0,24 мкм. Цитоплазма клетки имеет гранулярно-фибриллярное строение. В результате прохождения плоскости скола через мембраны бак" терии на криофрактограммах выявляют выпуклую (РР) и вогнутую (ЕР) поверх" ности внешней и цитоплаэматической мембран, Ha PF-поверхности внешней и цитоплазматической мембран обнаруживаются глобулярные (полиферментные) частицы. Таким образом, препарирование предлагаемым способом обеспечивает полную сохранность ультраструктурной организации биопрепаратов. На криофрактограммах, полу— ченных таким способом, можно провести фракционно-дисперсный анализ био,препаратов, т.е, определить форму, размеры и количественное распределение частиц биопрепарата по размерам.

Способ также позволяет исследовать характер распределения клеток биоагента в частицах препарата. На таких криофрактограммах также можно исследовать ультраструктурную топографию мембран и клеток биопрепарата.

Пример 1, Для исследова ния используют два сухих водорастворимых биопрепарата. БиопРепаРаты (2 мг )пропитывают в течение 1 мин в 0,2 мл I -ного раствора формвара на дихлорэтане. Полученную суспензию наносят на металлическую плашку и эамораживают в жидком фреоне-22, охлажденном жидким азотом в течение

5 с, затем образец переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженный образец скалывают на охлажденном столике (-170 С ) в вакуумно-замораживающей установке .(2х

-6 х 10 torr ). Реплику препарируют, как описанным способом.

Пример 2. Биопрепараты (2 мг1, указанные в примерах 1 и 2, пропитывают в течение 10 мин в

0,2 мл I -ного раствора формвара на дихлорэтане. Затем суспензию наносят на металлическую плашку и замораживают в жидком фреоне-22 на охлажденном столике (†1 С ) в вакуумнозамораживающей установке (2 х

-6 х 10 torr ). Дальнейшее препарирование реплик производят аналогично описанному.

Пример 3. Сухие водораство» римые биопрепар аты, указ анные в примере 1, по 2 мг каждый, пропитывают в течение 5 с, 1 и 10 мин в

1174380

10 з

0,2 мп 17.-ного раствора формвара на дихлорэтане. Полученные суспензии наносят на металлические плашки и замораживают в жидком фреоне-22 в течение 5 с, затем переносят в жидкий азот для окончательного замораживания. Замороженные образцы скалывают на охлажденном столике при

-160 С в вакуумно-замораживающей установке (2 х 10 torr ). .Реплики — 6 с поверхности сколов указанных образцов препарируют аналогично, Пример 4. Исследуемые биопрепараты по 2 мг каждый пропитывают в 0,2 мл 1%-ного раствора формвара на дихлорэтане в течение 5 с, 1 и 10 мин. Полученные суспензии наносят на поддерживающие диски и замораживают в жидком фреоне-. 22, охлажденном жидким азотом, в течение

5 с, затем переносят в жидкий азот для окончательного замораживания.

Замороженные образцы скалывают на охлажденном столике при — 150 С в вакуумно-замораживающей установке (2 х IO torr ). Реплики препарируют аналогично описанному.

Электронно-микроскопический анализ реплик с поверхности сколов сухих водорастворимых биопрепара— тов показывает, что при пропитывании биопрепаратов в 17.-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение

5 с, 1 и 10 мин и скалывании в вакуумно-замораживающей установке (2 10 torr ) при температуре столика от -150 С ультраструктурная о топография частиц биопрепаратов и клеток биоагента полностью сохраняется (таблица ).

Плоскость скола проходит через.

40 частицы биопрепарата или их естественные поверхности. В частицах биопрепарата выявляют бактериальные клет» ки, равномерно распределенные в защитной среде. Скол проходит также через естественные поверхности бактерии или через гидрофобные зоны высшей и цитоплаэматической мембран клеток. В результате .прохождения скола через гидрофобную зону мембран на 50 криофрактограммах выявляют PF (выпуклая) и HF (вогнутая ) поверхности внешней и цитоплазматических мембран. Ha PF-поверхности внешней и цитоплазмзтических мембран обнаруживают глобулярные 1полиферментные ) частицы. Изучение плотности, величины, лабильности таких частиц на поверхности мембран бактерии в обезвоженном состоянии (в анабиозе ) представляется важным при морфофункциональной оценке сухих водорастворимых .биопрепаратов и клеток, заключенных в них.

Исследование криофрактограмм таких объектов показывает также, что скол проходит и через цитоплазму клетки. Цитоплазма клеток в обезвоженном состоянии имеет фибриллярногрануляторное строение. Фибриллярные образования цитоплазмы соответствуют структурам нуклеотида.

Таким образом, выдерживание сухих водорастворимых биопрепаратоа в 17.— ном растворе формвара на дихлорэтане при их препарировании для криофрактографического анализа обеспечивает качественное и равномерное замораживание образца, что позволяет сохранить ультраструктурную топографию биопрепарата и клеток, эаключенных в нем.

Электронно-микроскопический ана! лиз реплик с поверхности сколов ,сухих водорастворимых биопрепаратов, пропитаных в 17.-ном растворе формвара на дихлорэтане в течение 5 с, 1 и

10 мин и сколотых в вакуумно-замора-, живающей установке (2 -10 tarr) при температуре столика — 140 С показывает, что реплики при их препарировании значительно повреждаются .. Это объясняется тем, что при температуре о

-140 С и выше дихлорэтан испаряется (табл. 1 ).

Изобретение .обеспечивает сохран« ность ультраструктурной топографии сухих водорастворимых биопрепаратов в процессе их препарирования для криофрактографического анализа, позволяет йзучить форму, размеры, ультраструктуру частиц биопрепаратов и характер распределения в них бактериальных клеток, позволяет исследовать естественную поверхность частиц биопрепарата, изучить ультраструктурную топографию естественных поверхностей клеточных структур и внутренних областей мембран бактерий в обезвоженном состоянии (в анабиозе ).

1174380

Условия препарирования

Исследуемые образцы

Температура столика при скалыв анин, OC

Время пропитыв аиия

Среда пропитывания (эамороживания ) 1Х-ный раствор формвара на дихлорэта« не

Сухие водорастворимые биопрепараты

5 с

-170

То же

-160

То же

It»

-150 ее»

-140

) мин

«ее»

«е!»

-160

-150

-140

-170

То же

-140

11»

» 100.. T

Составитель В, Чистяков

Техред Ж.Кастелевич

Корректор Л.Пилипенко

Редактор Н.Яцола

Заказ 5130/23 Ттраж 897

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4!5

Подписное

Филиап ППП "Патент", г,ужгород, ул.Проектная, 4

Сухие водораст- Минеральное воримые биопре- масло параты

-170

-160

-150

-140

-170

Качество реплик: сохранена ультраструктурная топография частиц биопрепаратов и клеток (+), не сохранена (— )