Способ определения дозы вакцины

Способ определения дозы вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ ВАКЦИНЫ путем оценки состояния морских свинок после иммунизации, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности определения, оценку состояния животных проводят путем выявления минимальной дозы, вызывающей снижение, и максимальной дозы, вызывающей увеличение энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов крови, далее вычисляют дозу по формуле Оч (Тд-Ид) X (i -jl-), где Оч - человеко-доза; Тд -минимальная доза, снижающая заряд; Ид-максимальная доза, увеличивающая заряд. с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5Ц4 А 61 В 1000

Ъ

fi <

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Р. = (҄— И ) х (=1), I6 12

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3528414/28- 14 (22) 25.10.82 (46) 30.08.85. Бюл. № 32 (72) Т. И. Анисимова, M. Ю. Ледванов, А. К. Адамов и А. И. Волосивец (71) Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (53) 615.375 (088.8) (56) Основные критерии отбора вакционных штаммпов чумного микроба. Методические указания. Саратов, 1976. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДОЗЫ

ВАКЦИНЫ путем оценки состояния морских свинок после иммунизации, отличаю„„SU„„1175438 щийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности определения, оценку состояния животных проводят путем выявления минимальной дозы, вызывающей снижение, и максимальной дозы, вызывающей увеличение энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов крови, далее вычисляют дозу по фор м ул е где Рц — человеко-доза;

Тд — минимальная доза, снижающая заряд;

Ид — максимальная доза, увеличивающая заряд.

1175438

Изобретение относится к медицине, в частности к патологической физиологии, и может быть использовано для комплексной оценки реактогенности и иммунобиологической активности вакцин.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности определения дозы вакцины.

Способ осуществляют следующим образом.

Определение человеко-дозы проводят в два этапа. На первом этапе определяют иммуногенную дозу вакцины для животных с помощью общепринятых иммунологических методик (реакции агглютинации, преципитации, вибриолиза, фагоцитоза и т.д.) или путем сравнительных расчетов по дозам ранее испытанных вакцин этого типа. На втором этапе в зависимости от цели эксперимента производят либо оценку иммуногенности разных серий вакцины или вакцинных штаммов, или выбор иммуногенной и ареактогенной дозы вакцины для человека по изменению энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов крови животных, вызываемому исследуемой вакциной.

Для оценки иммуногенности разных серий вакцин или разных вакцинных штаммов берут три группы морских свинок (по

10 особей в каждой). Первой группе вводят подкожно рекомендованную дозу вакцины А, второй — В, третьей — физиологической раствор и через 24 ч определяют энергетический заряд адениловой системы лимфоцитов. Вакцина, вызывающая достоверно более выраженное увеличение энергетического заряда адениловой системы лимфоцитов, оценивается как более иммуногенная и менее реактогенная.

С целью выбора иммуногенной и ареактогенной дозы вакцины для человека (нового вакцинного препарата, новой производственной серии, нового вакцинного штамма) исследуют энергетический заряд адениловой системы лимфоцитов крови морских свинок.

Для этого берут 11 групп животных по

10 особей в каждой группе. Первую группу животных иммунизируют подкожно дозой вакцины, выбранной на первом этапе по иммунологическим тестам или рассчитанной теоретически, с второй по десятую группы животных — дозами в 2, 4, 8, 16, 32 раза меньшими и в 2, 4, 8, 16, 32 раза большими дозами, чем та, которой иммунизировали первую группу животных. Одной группе вводят в качестве плацебо физиологический раствор (контрольная группа) .

Через 24 ч у животных определяют энергетический заряд адениловой системы лимфоцитов. Выделение лимфоцитов проводят общепринятым методом.

Энергетический заряд вычисляют по формуле Эткинсона на основании определения

40.

55 концентраций АТФ, АДФ, АМФ ферментным методом.

Принцип метода определения концентрации АТФ основан на сочетании ферментативных реакций дефосфорилирования содержащегося в крови АТФ и дегидрирования эквивалентного количества НАД.Н, по убыли которого (регистрируемой при помощи спектрофотометра при длине волны 340 нм) рассчитывают концентрацию АТФ. Определение концентрации АДФ и АМФ основано на реакции фосфорилирования (фосфоенолпируватом и пируваткиназой) содержащегося в без белковом экстракте лимфоцитов

АДФ и дегидрирования (лактатдегидрогеназной) эквивалентного количества НАД.Н

АМФ фосфорилируют в экстракте с помощью аденилаткиназы и определяют образовавшийся при этом АДФ (два эквивалента). Содержание АДФ и АМФ рассчитывают по убыли экстинкции при длине волны 340 нм.

Исследование проводят по следующей схеме.

Взятие крови. Кровь забирают из сердца в градуированную пробирку со шлифом и стеклянной пробкой (емкостью 20 мл). В пробирку предварительно наливают 5 мл среды 199 (для культуры тканей) с 2 — 3 каплями гепарина. Пробирку закрывают пробкой и осторожно перемешивают. В зависимости от того, сколько крови получено от животного (обычно 6 — 8 мл), в пробирку добавляют среду 199 так, чтобы отношение среда; кровь было 1: 1.

Приготовление градиента плотности.

76 /р-ный верографин смешивают с дистиллированной водой в пропорции 1:4,5, так как к ампуле верографина (20 мл) добавляют 90 мл воды и с помощью денсиметра выводят плотность раствора (добавлением верографина или воды) до 1,077 г/мл.

Центрифугирование. В химически чистые центрифужные пробирки емкостью 10 мл с внутренним диаметром 12 — 13 мм до половины наливают водный раствор верографина с плотностью 1,077 г/мл. Затем в пастеровскую пипетку набирают разведенную кровь и осторожно по стенке, удерживая пробирку в наклонном положении (45 ), наслаивают кровь на раствор верографина. Соотношение объемов составляет 1:1. Пробирки центрифугируют 15 мин при 420 g. В результате лимфоциты занимают положение в середине пробирки над слоем верографина в виде беловатого кольца. Над лимфоцитами находится диффузный мутный слой тромбоцитов, а еще выше — прозрачная плазма.

На дне пробирки собираются эритроциты и гранулоциты. В слое расположенного над ними верографина находятся в виде легкого помутнения агрегаты гранулоцитов с тромбоцитами и лимфоцитами. Пользуясь

1175438 пастеровской пипеткой, соединенной трубочкой со шприцом, отсасывают слой лимфоцитов. При отсасывании нужно соблюдать максимальную осторожность, чтобы не вызвать перемешивания. Полученная взвесь неизбежно содержит примесь верографина и тромбоцитов. Чтобы отмыть примесь, полученную суспензию лимфоцитов смешивают в отношении 1:2 со средой 199 и центрифугируют 10 мин при 15000 об./мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок

10 суспензируют в среде 199, доводя объем до

4 мл. Все перечисленные процедуры необходимо проводить при температуре не выше +4 С. Далее в лимфоцитах определяют концентрации АТФ, АДФ, АМФ, 15

Определение АТФ. 1 мл лимфоцитарной суспензии помещают в центрифужную пробирку и добавляют 4 мл охлажденной 0,6 н хлорной кислоты. Хорошо смешивают и оставляют при комнатной температуре 10 мин.

Затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость отделяют. В чистую стеклянную кювету спектрофотометра с длиной световой дорожки 1 см помещают 2 мл реактива, содержащего триэтаноламиновый эфир (0,5 М), сульфат магния (4 ммоль), 3-фосфоглицерат (6ммоль).

Последовательно добавляют 0,2 мл 2,5 ммоль раствора НАД.Н и 0,2 мл полученной надосадочной жидкости. Содержимое кюветы тщательно перемешивают и через 5 мин на спектрофотометре при длине волны 340 нм З0 определяют оптическую плотность Е . Измерение проводят против воздуха. Если оптическая плотность выше 0,500 и в используемом спектрофотометре нет фотоумножителя, измерение можно проводить против раствора пикриновой кислоты (1 — 2 капли

1,2О/о-ной пикриновой кислоты на 100 мл воды). Далее в эту же кювету добавляют

0,02 мл суспензии, содержащей смесь ферментных препаратов — глицеринальдегидфосфат дегидрогеназы и фосфоглицерат- 40 киназы. Ферменты должны находиться в концентрациях не ниже 560 и 80 ИЕ/мл соответственно. Содержимое кюветы перемешивают и через 10 — 15 мин (пока не прекратится реакция) определяют оптическую плот45 ность Еа. Концентрацию АТФ рассчитывают по следующей формуле

АТФ (мкмоль/мл лимфоцитарной суспензии) = (Е1 — Е ) Х 4,71.

Определение концентрации АДФ. 3 мл лимфоцйтарной суспензии помещают в цен50 трифужную пробирку и прибавляют 3 мл охлажденной 1 н. хлорной кислоты, хорошо смешивают и оставляют при комнатной температуре 10 мин. Затем центрифугируют при 3000 об/мин. 4,0 мл надосадочной жид- 55 кости переливают в новую пробирку и добавляют туда 0,8 мл реактива, содержащего

К СОз (0,5М) и триэтаноламиновый буфер (0,5М). Смешивают и оставляют в ванне со льдом !О мин. После этого при комнатной температуре фильтруют. В чистую стеклянную кювету с длиной световой дорожки 1 см последовательно помещают 2,0 мл фильтрата, 0,2 мл реактива, содержащего фосфенол,.ру.. (10 MMOJlb), Ксе (1,3М), MgSOg (0,4 M), а также 0,2 нм НАД.Н (2,5 ммоль) и 0,02 мл суспензии лактатдегидрогеназы в концентрации 320 ИЕ/мл. Содержимое кюветы тщательно перемешивают и через 5 мин измеряют оптическую плотность Е при длине волны 340 нм против воздуха (или раствора пикриновой кислоты). Далее добавляют

0,02 мл суспензии пируваткиназы в концентрации 320 МЕ/мл. Содержимое кюветы перемешивают и через 5 — 10 мин (пока не остановится реакция) определяют оптическую плотность Ед. Концентрацию АДФ рассчитывают по следующей формуле.

АДФ (мкмоль АДФ/мл суспензии лимфоцитов) = (E1 — Е ) X 0,4354.

Определение концентрации ЛМФ. После определения оптической плотности Е в ту же кювету добавляют 0,002 мл суспензии аден ил аткиназы 500 И Е/мл. Смешивают и через 15 — 20 мин (пока не прекратится реакция) определяют оптическую плотность Е .

Концентрацию АМФ рассчитывают по следующей формуле.

ЛМФ (мкмоль АМФ/мл суспензии лимфоцитов) = (Š— Ез) Х 0,2189.

Определение энергетического заряда. После определения концентраций адениловых нуклеотидов в суспензии лимфоцитов рассчитывают энергетический заряд адениловой системы по формуле

2 АТФ) + АДФ 1 (АТФ) + (ЛДФ) + (АМФ) где (АТФ), (АДФ), (АМФ) — концентрация АТФ, АДФ, АМФ, мкмоль/мл суспензии лимфоцитов.

Иммуногенную и ареактогенную дозу д1я человека рассчитывают по формуле ВЧ вЂ”вЂ”

= 1/16 (Тд — Ид). где Эч — человеко-доза, выраженная в количестве клеток живой вакцины или в единицах активности химической вакцины (мг белка, ЕС или др.); Тд — токсическая доза вакцины: Ид — иммуногенная доза вакцины.

Пример 1. Сравнительная оценка двух разных субкультур вакцинного штамма EB: линии НИИЭГ сушки 1979 г. и линии «япон-. ск а я» сушки 1952 г.

В опыт были взяты три группы животных:

1-я — контрольная, в качестве плацеоо вводился физиологический раствор (10 животных); 2-я иммунизированные 100 тыс. микр, кл. вакцинного штамма ЕВ линии

НИИЭГ (10 животных); 3-я — иммунизи1175438 рова нные 100 тыс. м икр. кл. вакцин ного штамма ЕВ линия «японская» (10 животных) .

Через 24 ч в лимфоцитах крови был определен энергетический заряд системы аденилатов. В контрольной группе — 0,724 +

+ 0,018, а в группе животных, иммунизированных японской линией, — 0,805 +. 0,010, линией НИИЭГ (P (0,05). Следовательно, ее следует считать более иммуногенной.

Такой вывод был проведен общепринятыми методами. Морским свинкам вводили однократно подкожно в объеме 0,5 мл по 40, 200, 1000, 5000 микробных клеток двухсуточной агаровой культуры, белым мышам по 200, 1000, 5000, 25000 микробных клеток в объеме 0,2 мл. На каждую дозу взято по 10 животных. Заражение вакцинированных животных (200 DCL) вирулентной культуры

1. pestis проводили на 21-е сут. после вакцинации. В качестве контроля заражались чумой по 5 вакцинированных морских свинок по 200 и 1 0С) (1 DCL — 50 микр. кл.) .

Все контрольные животные погибли.

Результаты определения иммуногенности культур приведены в таблице. Из этой таблицы видно, что японская линия вакцинного штамма чумного микроба неиммуногенна, так как ни одно из вакционированных животных не выжило, т.е. по иммуногенности эта субкультура штамма ЕВ не соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам.

Вакцинный штамм чумного микроба линии НИИЭГ, принятый в качестве маточной культуры в производстве чумной вакцины, высоко иммуногенен.

Пример 2. С целью выбора безвредной и иммуногенной дозы вакцины 6 группам морских свинок (по 10 особей в каждой) ввели подкожно 1 тыс., 100 тыс, 300 млн., 1200 млн., 4860 млн., 9600 млн. клеток живой чумной вакцины 1. Pestis EV. Контролем служили 10 животных, которым был введен физиологический раствор. Через 24 ч после иммунизации в лимфоцитах крови по описанной методике определяли энергетический заряд адениловой системы.

Иммуногенная доза (Ид) для морских свинок составляет 4800 млн. клеток вакцины, токсическая доза (Тд) — 9600 млн. кл.

Одна человеко-доза составляет Дч =

= К (Тд — Ид) = (9600 млн. — 4800 млн) Х

X 1/16 = 300 млн. Эта серия вакцины была проверена на людях. У людей в указанной

15 дозе отмечалась выраженная иммунологическая перестройка и отсутствовали недопустимые поствакцинальные реакции, т. е. выбранная доза была иммуногенной и ареактогенной.

Пример 3. Выбор безвредной и иммуногенной человеко-дозы холерогена-анатоксина серии 2.

С целью выбора безвредной и иммуногенной дозы препарата 6 группам свинок морских (по 10 особей в каждой) введено

25 подкожно 4800, 9600, 19200, 38400, 76800, 153600 ЕС токсина. Контрольной группе морских свинок в качестве плацебо вводился физиологический раствор. Через 24 ч в лимфоцитах определяли энергетический заряд адениловой системы.

Для животных максимальная иммунизирующая доза (Ид) холерогена-анатоксина составляет 9600 ЕС, токсическая доза (Тд) — 38400 ЕС. Одна человеко-доза составляет Дg — — К(Тд — H„) = (38400 ЕС—

9600 ЕС) ° 1/16 = 1800 ЕС.

Согласно проведенным комиссионным испытаниям, человеко-доза холерогена-анатокс и на сост авл яет в среднем 1800 — 2400 ЕС

1175438

x x и td

Д lg О) х 3

1 1

1 1

Ю

Ю

1Г\ 1

Ю

Ю о

М I

Ю

° 1 I

Р, 1 Л

Х 1 I уllзll

С»!

Р з

1ч о

Ю

1 Р Ф

1 Ф Х

l4 X l X I о ххе

SI-XOg

vomxo

oos Р.

Ю

Ю

Р»

Ю

Ю

C)

Ч

Р»

1 I

Р Ф ХР» э х ц

o o m a> x =т X Р, Z X

C) ч о Я

f +1 х

I» Е

"Р

Ю

Ю

А о

Ц а

I х о

< 1

CO

Э Р х щ

F) О) v к о 6

Й

Ц и

Н Х

1О Р, и И

В

W л о ц о

v m

Р1 (О о х ц х

Э Ж

Р

6!

О)

o !. ц о

U ф

Р 1

I <»! 1

I 1

1 2 I

I Л

1 Ю

1 Ю

1 3 ! Ю

Ц !! Ю

Ю

Р, с»!

O Ю Ю О

Ю Ю Ю Ю

Ю сч сч

О!

Ю Ю л

Ю Ю

Ю Ю и и

О

Ю

Ю

+1

О Ъ

Ю

СО

C) CO

Ю

Ю

Ф

CV !

Ю