Способ получения препарата инактивированного поверхностного антигена гепатита @ для активной иммунизации

Способ получения препарата инактивированного поверхностного антигена гепатита @ для активной иммунизации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНАКТИВИРОВАННОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА В ДЛЯ АКТИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ путем выделения и очистки антигена из плазмы или сыворотки крови людеи-антигеноносителей и последующей инактивации, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повыщения стабильности и иммуногенности препарата, плазму или сыворотку прогревают , из полученной надосадочной жидкости осаждают антиген полиэтиленгликолем, осадок последовательно обрабатывают пепсином и твином-80 с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и выделением очищенного антигена, который затем обрабатывают смесью формальдегида и Е-лейцина и сорбируют на гидроокиси алюминия. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прогревание осуществляют при 80°С в течение 60 мин, осаждение полиэтиленгликосг лем проводят при концентрации 15%, обрабатывают пепсином в концентрации 0,01% сл и твином-80 в концентрации 1%, а смесь 0,ООЗЗМ формальдегида и 0,066М Е-лейцина берут в молярном соотнощении 1:20.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1175489 А (и)4 А 61 К 39 12

3CKQN)3 g

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

13,",",, ;,",„13

БИБЛИО ЩЦ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3508965/28-14 (22) 15.07.82 (46) 30.08.85. Бюл. № 32 (72) С. О. Вязов, В. А. Ананьев, М. И. Михайлов, Т. В. Голосова, Е. М. Власихина, А. Н. Марголина, А. М. Поверенный и Ю. А. Семин (71) Институт вирусологии им. Д. И. Ивановского, Центральный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови и Научно-исследовательский институт медицинской радиологии АМН

СССР (53) 615.373(088.8) (56) Патент США № 4017360, кл. А 61 К 39/12, 1977. (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИНАКТИВИРОВАННОГО ПОВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ГЕПАТИТА

В ДЛЯ АКТИВНОЙ ИММУНИЗАЦИИ путем выделения и очистки антигена из плазмы или сыворотки крови людей-антигеноносителей и последующей инактивации, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения стабильности и иммуногенности препарата, плазму или сыворотку прогревают, из полученной надосадочной жидкости осаждают антиген полиэтиленгликолем, осадок последовательно обрабатывают пепсином и твином-80 с последующим центрифугированием в градиенте плотности сахарозы и выделением очищенного антигена, который затем обрабатывают смесью формальдегида и Е-лейцина и сорбируют на гидроокиси алюминия.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что прогревание осуществляют при 80 С в течение 60 мин, осаждение полиэтиленглико- а лем проводят при концентрации 15%, обрабатывают пепсином в концентрации 0,01% фу и твином-80 в концентрации 1%, а смесь %УФ

0,0033М форм альдегида и 0,066М Е-лейцина берут в молярном соотношении 1:20.

>вей

)ай

С

4ь

QO сО

1175489

50

Изобретение относится к медицине, преимущественно к приготовлению специфических антигенов, антисывороток и иммунодиагностикумов, и может быть использовано для специфической профилактики вирусного гепатита В.

Целью изобретения является повышение безвредности, стабильности и иммуногенности антигена.

Способ выполняется следующим образом.

На стадии очистки антигена — НВ,Ад в предлагаемом способе используют такие простые и недлительные этапы очистки, как прогревание и осаждение полиэтиленгликолем, не требующие применения сложного оборудования и дорогостоящих реактивов, и обеспечивающие высокую степень очистки НВ,А, сопоставимую с величиной, достигаемой в способе-прототипе. Последующая стадия очистки по разработанному способу состоит из двух этапов: обработка материала пепсином, добавление твина-80 и однократное центрифугирование в градиенте сахарозы в стандартном роторе, а в прототипе используют три этапа: обработка пепсином, обработка мочевиной и колоночная хроматография.

На стадии инактивации в качестве инактивирующего агента для обработки очищенного НВ,Ад используют смесь формальдегида с аминокислотами Е-лейцином или глицином.

В предлагаемом способе инактивирующее воздействие осуществляется двукратно — на стадии очистки НВ,А (этап прогревания исходной плазмы или сыворотки крови) и на стадии обработки очищенного препарата НВ,А смесью формальдегида и аминокислот. Это обеспечивает жесткий режим инактивации инфекционности и направлено на достижение более полной специфической безвредности целевого продукта. Кроме того, применение инактивирующего воздействия на первом этапе осуществления предлагаемого способа повышает личную безопасность технического персонала на последующих этапах работы.

На заключительном этапе предлагаемого способа препарат НВ,А после инактивирующей обработки подвергают стерилизующей фильтрации и сорбируют на гидроокиси алюминия. Последнее приводит к усилению иммунногенной активности продукта по сравнению с несорбированным антигеном за счет замедленной ресорбции антигенного материала из создаваемого в тканях реципиентата депо.

Пример. Очистка НВ.А . Исходный материал — 900 мл плазмы крови человеканосителя НВ,Ад (титр по методу встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ) 1:8, титр с сывороткой, преципитирующей белки сыворотки крови человека — 1:5112), прогревали при температуре 80 С 60 мин сгусток денатурированных белков отделяли центрифугированием при 9000 об/мин в течение

30 мин. К надосадочной жидкости добавляли 50О -ный водный раствор полиэтиленгликоля 6000 до конечной концентрации 15Я.

Сформировавшийся в течение трех часов осадок отделяли центрифугированием при

9000 об/мин в течение 20 мин и растворяли в 50 мл физиологического раствора хлорида натрия, после чего рН доводили до 2,2 добавлением 1ИНС1. К полученной суспензии добавляли пепсин до конечной концентрации 0,01Я и смесь инкубировали при 37 С в течение 16 ч. После окончания инкубации к раствору добавляли твин-80 до конечной концентрации 1Я и полученную смесь наносили на линейный градиент концентрации сахарозы (10 — ЗОЯ) и центрифугировали при 70000)(g в течение 12 ч.

Полученный препарат очищенного НВ,Ад имел следующие характеристики: объем

60 мл, концентрация белка 50 мкг/мл; титр

НВ,А по методу ВИЭФ 1:8, после концентрирования в 10 раз титр с сывороткой, преципитирующий белки человека, равнялся нулю.

Обработка очищенного НВ,А формальдегидом в смеси с Е-лейцином.

Первоначально готовили 0,264 М раствор

Е-лейцина и 0,0132 М раствор формальдегида (исходный 40Я-ный раствор разводили в 855 раз) на стерильном апирогенном изотоническом растворе хлорида натрия рН 6,8.

Полученные растворы и препарат очищенного НВ,А смешивали при соотношении объемов 1:1:2 (конечная концентрация формальдегида и аминокислоты 0,0033 М и 0,066

М соответственно) и инкубировали при комнатной температуре 72 ч. Затем смесь подвергали стерилизующей фильтрации через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор

0,23 ммк.

Полученный препарат НВ,А имел следующие характеристики: объем 120 мл, концентрация белка 25 мкг/мл, титр НВ,Ад 1:4.

Стабильность инактивированного препарата НВ,Ад в процессе хранения при +4 С представлена в табл. 1.

1175489

Таблица 1

Активность препарата (титр в РИА) Препарат НВ А> инактивирован

0 день 1 день 1 мес 6 мес 9 мес 12 мес

Смесью формальдегида и Š†лейцина

1/8192 1/4096 1/4096 1/4096 1/4096 1/4096

Чистым формальдегидом (по способупрототипу) 1/8192 1/4096 1/4096 1/4096 1/2048 1/1024

Т абли ца 2

3/3

2,0х1,0

5,0 "1,3

57,0х1,3

0,5

3/3

2,0

3/3

5,0

Таблица 3

Степень сероконверсии

Доза, мкг

Средняя геометрическая обратного титра

Нативный С орбирован Нативный

Сорбирован

5/5

О/5

4,0х1,5

7,0х1,4

12,1"1,4

3/5

5/5

1,6х1,4

3,0л1,2

5/5

5/5

" радиоиммунологический метод.

"" активность препарата до инактивирующей обработки; концентрация белка (50 мкг/мл) в 2 раза превышает концентрацию белка в обработанных препаратах.

Сорбция обезвреженного препарата

НВ,А на гидроокиси алюминия.

К препарату НВ,А, обработанному формальдегидом в присутствии Е-лейцина, добавляли стерильный гель (Аl (OH) з), содержащий 11 мг/мл основного вещества в изотоническом апирогенном растворе хлорида натрия рН 6 8, из расчета 25 мкг белка на 1 мг сорбента (0,1 мл раствора геля— на 1 мл раствора белка). Смесь инкубировали при комнатной температуре и после- рр дующие 48 ч — при +4 С. Полноту сорбции контролировали титрованием НВ,Ад в надосадочной жидкости после осаждения сорбента. Взвесь адсорбированного антигена разливали в стерильные ампулы в объеме 1 мл и хранили при +4 С. 35

Оценка иммуногенности конечного продукта.

Различные разведения конечного продукта в объеме 1 мл изотонического раствора хлорида натрия двукратно с интервалом в 2 недели вводили морским свинкам 4Р подкожно в область спины. Использовали самцов массой 200 — 300 г. Максимальный титр анти- НВ, отмечали методом ВИЭФ на 4-й неделе от начала иммунизации (табл 2).

Доза, Средняя геомет- Степень серомкг рического об- конверсии ратного титра

Повы шение иммуногенной активности

НВ,А, обработанного формальдегидом в смеси с Е-лейцином, за счет сорбции на гидроокиси алюминия выявляли следующим образом.

Белых мышей, самцов, массой 18 — 20 r, иммунизировали различными разведениями

НВ,А, сорбированного и несорбированного на гидроокиси алюминия, материал вводили однократно внутрибрюшинно, учет результатов методом ВИЭФ проводили через 4 недели от начала иммунизации (табл. 3).

Адсорбция продукта на Аl(ОН)з достоверно увеличивала иммуногенную активность (Р(0,05) .

1175489

Составитель П. Бонарцев

Редактор Т. Митейко Техред И. Верее Корректор Л. Бескид

Заказ 5247/6 Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Оценка безвредности целевого продукта при заражении шимпанзе.

Шимпанзе вводили внутримышечно

100 мкг очищенного и инактивированного

НВ,А . На протяжении 6 мес. с момента введения препарата у животного не отмечали появления признаков инфекции, вызываемой вирусом гепатита  — антигенемии, повышения уровня трансаминаз и появления антител к внутреннему антигену вируса.

Характеристика конечного продукта: объем материала в 1 ампуле 1 мл; растворитель — изотонический раствор 0,9о/0-ного хлорида натрия рН 5,0, 7,0; количество белка, измеренное по методу Лоури, 5 — 50 мкг; количество гидроокиси алюминия не более

1 мг; количество аминокислот 6,0 — 13,0 мг; концентрация остаточного формальдегида не более 0,003 мг/мл.

Препарат стерилен, апирогенен, неинфек- 20 ционен.

Препарат способен индуцировать синтез специфических антител у животных.

Препарат не вызывает гепатита В у шимпанзе.

Конечный продукт разливается в стерильные ампулы и хранится при 4 С.

Необходимость разработки наиболее эффективного средства борьбы с НВ-вирусной инфекцией — вакционного препарата против гепатита  — объясняется тем, что в СССР такой препарат отсутствует.

Использование предлагаемого способа получения инактивированного поверхностного антигена гепатита В для активной иммунизации обеспечивает возможность получения высокоочищенного препарата НВ,А в результате применения простых и нетрудоемких методов очистки при одновременном сокращении длительности процедуры очистки и отказе от использования дорогостоящего и сложного в эксплуатации оборудования, повышение безопасности конечного продукта за счет использования двух этапов инактивирующего воздействия и применения более сильного и эффективного инактивирующего агента-аминометилольного производного формальдегида, повышение стабильности и иммуногенности конечного продукта в результате использования аминометилольного производного формальдегида и применения сорбента-адъюванта и повышение личной безопасности технического персонала в процессе работы за счет применения инактивирующего воздействия на первом этапе очистки НВ,Аа.