Способ электрохимического определения глюкозы и электрод для его осуществления

Способ электрохимического определения глюкозы и электрод для его осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Способ электрохимического определения глюкозы, заключающийся в наложении потенциала на ф ерментньй электрод, отличаю14ийся. тем, что, с целью повышения чувствительности , перед наложением потенциала ферментный электрод выдерживают в анализируемом растворе при 7,0 рН 6 7,5 в течение 1,5-12 мин, после чего измеряют количество электричества , пропорциональное содержанию глюкозы. 2.Электрод для электрохимического определения глюкозы, содержащий токопроводящий слой, соединенньй с токоотводом и ферментньй слой, отличающийся тем, что, с целью, повышения чувствительности определения , электрод допо тшительно снабжен слоем сажевой пасты, размещенным меж ду токопроводящим и ферментным слоя (О ми. 3.Электрод по п.2, отличающийся тем, что токопроводящий слой выполнен из комплекса N-метилфеназиния и тетрадиано-п-хинодимета; на.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (5 )4 С 01 N 27/42

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ (21) 3744192/24-25 (22) 24. 05. 84 (46) 23. 09. 85. Бюл. ¹ 35 (72, Ю.Ю. Кулис, Н. К. Ченас, В.Й. Разумас, А.С.Самалюс и П.П.Микульскис (7i) Институт биохимии АН ЛитССР

,53) 547.455.623:543.25 (088.8) (56) Колб В.Г. и Камышников В ° С.

Справочник по клинической химии.

Минск: Беларусь, 1982, с. 168-171.

Патент США ¹ 3623960, кл. G 01 N 27/46, опублик. 1971. (54) СПОСОБ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ И ЭЛЕКТРОД ДЛЯ ЕГО

ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ. (57) 1. Способ электрохимического определения глюкозы, заключающийся в наложении потенциала на ф ерментный электрод, о т л и ч а ю Щ и и с я . тем, что, с целью повышения чувствительности, перед наложением потенциа„„SU„„»SOZZ> ла ферментный электрод выдержив ают в анализируемом растворе при 7,0 < а рН 6 7,5 в течение !,5-12 мин, после чего измеряют количество электричества, пропорциональное содержанию глюкозы.

2. Электрод для электрохимического определения глюкозы, содержащий токопроводящий слой, соединенный с токоотводом и ферментный слой, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения, электрод дополнительно снабжен слоем сажевой пасты, размещенным между токопроводящим и ферментным слоями.

3. Электрод по п.2, о т л и ч а юшийся тем, что токопроводящий слой выполнен из комплекса N-метилфеназиния и тетрациано-и-хинодимета= на.

1180771

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине для определения концентрации глюкозы.

Цель изобретения — увеличение 5 чувствительности способа.

Пример 1. Определение глю.козы на электроде, модифицированном сажей.

Стеклоуглеродный электрод с раба- 10 чей поверхностью 0,1 см получают путем нанесения на его поверхность

1 мг пасты из сажи марки IIN-105 и воды (1:2 по весу). Затем на элект" род наносят 10 мкл раствора глюко- l5 зооксидазы (60 мкМ), наверх надевают диализную мембрану и закрепляют ее резиновым кольцом. Далее электрод погружают в 0,1 М фосфатный буфер рН 7,0 в электролизной ячейке и задают ему потенциал 0,0 В отнооительно Ag/AgCl. электрода сравнения.

После 10 мин вводят 10 или 20 мкМ глюкозы и проводят накопление в течение 1,5-8 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 10 с.

В табл. 1 приведены данные зависи-.эО мости накопленного электричества от времени накопления при определении глюкозы (рН 7,0, 0,1 М фосфатный буфер).

Таблица 2

Концентрация глюкозы, мкМ

2,2

5,2

Таблица

4,4

10,4

Количество электричества, мкКл, при концентрации глюкозы, мкМ 40

Время на копления

15,4 мин

19,5

8,7

20

100

10,7

22,5

12„2

24,5

120

25,0

180

25,5

30

Из табл. 2 видно, что при времени накопления 1,5 или 4 мин график определения глюкозы линеен до 110 у и 70 мкМ соответственно. Нижний предел определения метаболита составля= ет 20 мкМ. Электрод сохраняет работоспособность 5 дн.

Пример 2. Определение глюкозы на электроде, модифицированном редокс полимером.

Стеклоуглеродный электрод с рабочей поверхностью 0,1 см модифицируют путем ацсорбции из 0,27-ного водного раствора редокс полимера— поливинилпиримидина, кватернизованного 2-бромбензохиноном в течение

5 мин. Затем электрод промывают водой, на его поверхность наносят

10 мкл раствора глюкозооксидазы (60 мкМ), наверх надевают диализ ную мембрану, которую закрепляют резиновым кольцом. Электрод погружают в

0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0) в электролизной ячейке и задают потенциал 0,03 В относительно Ag/AgC1 электроца сравнения. После 10 мин вводят 20-200 мМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 1,5 или 4 мин. По истечении этого времени биполярным ключом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с.

Данные определения глюкозы (рН 7,0; 0,1 М фосфатный буферный раствор) приведены в табл. 2.

Количество элейтричества, мкКл, при времени накопления, мин

1180771

Таблица 3

Т а б л и ц а 4 —,у"

Время накопления, мин акопленного а, мкКл, при пленяя, мин (1О

0,3 0,5

10

1,2

4,2

2,7

1 5

5 0

2,5

3,6

5,1

7,1

3,6

5О 30

6,8

12,4

6,2

8,1

17,0

8,5

12

9,0

21,7

10,8

90.

14 5

120

Пример 3. Определение накопления элек"ричества глюкозы в зависимости от времени и степени модификации электрода редокс полимером.

Стеклоуглеродный электрод с ра6о- 5 чей поверхностью 0,1 см модифицируют путем адсорбции из 0,27-ного этапольного раствора полигидрохлорида в течение 2 или 5 мин. Затем электрод промывают этанолом и водой, погружают в 0,1 M фосфатный буфер (рН 7,0) и путем записи циклической вольтамперограммы определяют степень модификации электрода редокс группами, составляющую 0,3 и 0,5 нмоль.см 15 соответственно. Затем на поверхность электрода наносят 10 мкл раствора глюкоэооксидазы (60 MKM) покрывают диализной мембраной, которую закрепляют резиновым кольцом. Электроду 2О задают потенциал 0,0 В относительно

Ag/AgCl электрода сравнения. После

10 мин вводят 80 мкМ глюкозы и проводят накопление в течение 1,5; 3; 5;

8; 12 мин. По истечении этого времени биполярным кольцом 2 включают потенциал 0,4 В и определяют количество накопленного электричества в течение 30 с.

Данные зависимости количества на- Зр копленного электричества глюкозы от времени и степени модификации электрода (концентрация глюкозы

80 мкМ в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0, t 25 С) приведены в табл. 3.

Количество электричества, мкКл, при степени моди- 4р фикации, нмоль см

Из приведенных данных видно, что предельная величина накопленного электричества достигается при времени накопления более 12 мин. Количество накопленного электричества увеличивается с увеличением степени модификации электрода редокс полимером.

Пример 4. Определение глюкозы на электроде из токопроводящего органического комплекса.

Электрод, полученный путем прессования токопроводящего комплекса тетрациано-и-хинодиметана и N-метилфеназиния, с рабочей поверхностью

0,3 см, содержащий под диалиэной мембраной 10 мкм раствора глюкозооксидазы (60 мкИ), погружают в О,1 И фосфатный буфер (pH 7,0) в электролизной ячейке. Электроду задают потенциал 0,3 В относительно Ag/AgC1 электрода сравнения и выдерживают

10 мин. После этого вводят 10200 мкИ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) глюкозы и проводят накопление в течение 5-10 мин. По истечении этого времени биполярным ключом включают потенциал 0,0 В и в течение

60 с определяют количество накоплен,ного электричества.

Данные зависимости накопленного электричества при определении глюкозы (рН 7,0; 0,1 М фосфатный буфер) приведены в табл. 4.

1180771

Продолжение табл. 4 тво накопленного ичества,мкКл,при накопления, мин

Таблица 5

160

19,5

38,4

Количество электричества, мкКл, при времени накопления, мин

Концентрация лактата, мкМ, при времени накопления, мин

200

5 20

5 20

0,02 0,032

0,18 1„0

0,36 2,5

0,86 6,2

1,18 8,2

i 26 10,5

1,28 10,6

0,04

0,12

0,14

0,30

0,36 О, 44

О 76 . О 74

1,04

1,20

i 30 10,7

1,48 2,00

Из приведенных данных видно, что количество накопленного электричества с использованием токопроводящих комплексов пропорционально количеству глюкозы и времени накопления.

Нижний предел определения метаболита составляет 10 мкМ.

Пример S. Определение глю- 20 козы в крови.

Исследования проводят аналогично примеру 4 эа исключением введения

0,1 мл десятикратно разбавленной буферным раствором крови человека вмес25 то раствора глюкозы в электрохимическую ячейку объемом 5 мл. При времени накопления 10 мин количество накопленного электричества составляет

2,35 мкКл. Концентрация глюкозы в крови, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет (с учетом разбавлений) 5,1 мМ (91,9 мг.Ж), что близко физиологическому уровню метаболита (80-100.мг Ж). 35

Пример 6. Определение концентрации лактата.

Графитовый электрод с рабочей площадью электрода 0,15 см погружают в 9,2 мкМ раствора цитохрома В 40 в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0) в течение 2 ч. Потом электрод отмывают тем же буфером и погружают в

2 мл буферного раствора в электролизной ячейке. На электрод задают 45 потенциал величиной 0,2 В относительно Ag/AgC1 электрода сравнения.

После 10 мин вводят 10 мкл 0,0040,2 мМ L-лактата (интервал концентрации для построения калибровочного графика) и проводят накопление в течение S ипи 20 мин. По истечении этого времени биполярным ключом 2 включают потенциал 0,2 В и определяют количество накопленного электричест- 55 ва в течение 2 с.

Данные определения лактата (рН 7,0

0,1 И фосфатный буферный раствор.

25 C) приведены в табл. 5. Из приведенных данных строится калибровочный график зависимости количества накопленного электричества от концентрации Ь-лактата в ячейке.

Калибровочный график определения лактата линеен до 0,16 и 0,44 мкМ при 5 и 20 мин накопления. Нижний предел определения метаболита составляет 0,020 (5 мин накопления) или

0,032 мкИ (20 мин накопления). Электрод сохраняет работоспособность в тетечение 7 дн.

Пример 7. Определение лактата в слюне.

Аналогично примеру 6 за исключением введения 10 мкл десятикратно разбавленной буферным раствором слюны вместо раствора лактата. При времени накопления 20 мин количество накопленного электричества составляет 5 9; 6,4 и 7 5 мкКл для разных образцов. Концентрация молочной кислоты в слюне, рассчитанная на основе калибровочного графика, составляет 0,59; 0,64 и 0,76 мИ, что близко физиологическому уровню метаболита (7,4 мг 7. по известным данным).

Hp и м е р 8. Определение концентрации Н О .

На поверхность графитового электрода, импрегнированного парафи1180771

Таблица б

Концентра5 ция Н2029 мкМ

Количество электричества, мкКл, при времени накопления, мин

0,23

0,5 10

0,7

1,2

1,0

1,7

1,3

2,1

1,7

2,8

30

2,0

3,5

Составитель А.Федосеев

Редактор О.Черниченко Техред О.Неце Корректор И, Эрдейи

Заказ 5913/41 Тираж 896 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ном (0,018 см ) наносят 10 мкл раствора пероксидазы растительного происхождения (!0 мкМ) в 0,1 М фосфатцитратном буфере (рН 5,2). Раствор фиксируют на поверхности при помощи диализной мембраны, закрепляемой на корпусе электрода резиновым кольцом.

Электрод погружают в электрохимическую ячейку, содержащую 25 мл

0 1 М фосфат-цитратного буфера, рН 5,2, t 25 С, задают потенциал

0,4 В относительно Ag/AgC1 электрода сравнения. и выдерживают при нем

10 мин. После этого в ячейку вводят

0,2 мл 0,63-3,78 мМ (интервал концентраций для построения калибровочного графика) раствор перекиси водорода в том же буферном растворе и проводят накопление электричества в течение 1 или 2 мин (в реакционной смеси из-за разбавления концентрации Н О составляет 5-30 мкМ).

По истечении времени накопления биполярным ключом включают потенциал

0,0 В и определяют количество накопленного электричества в течение 2 с с задержкой начала измерения 120 мс, Данные определения Н2Ор (рН 5,2;

О,l М фосфат-цитратный буферный раст вор, е 25 С) приведены в табл. 6

Из приведенных данных видно, что

25 при времени накопления 1 или 2 мин калибровочные графики определения перекиси водорода линейны до 30 мкМ.

Нижний предел определения Н О f мкМ.

Электрод сохраняет работоспособность о в течение месяца при 4 С.