Способ получения экстрагента холестерина

Способ получения экстрагента холестерина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАГЕНТА ХОЛЕСТЕРИПА путем смешивания фосфатидилхолина и детергента, отличающийся тем, что, с целью повышения емкости по холестерину, суспензию, содержащую 1 мае. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1-0,4 мае. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000-9000 в массовом соотношении 1-9: и 0,002-0,04 мае. ч. иетилтриметиламмонийбромида , при содержании фосфатидилхолина 10-35 мг/мл облучают ультразвуком при О-4°С в течение 1 - 10 мин. (Л 00 со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)4 А 61 К 37/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ У СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3654449/28-13 (22) 26.10.83 (46) 07.10.85. Бюл. № 37 (72) Е. А. Бородин, С. С. Маркин, Э. М, Халилов, А. И. Арчаков и Ю. М. Лопухин (71) 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова (53) 612.111.19:612.397.81 (088.8) (56) 1. Бородин Е. А., Добрецов Г. E., Карасевич Е. И. и др. Влияние встраивания и выведения холестерина на вязкость липидного бислоя и скорость окислительных процессов в мембранах микросом печени крысы. 1981, Биохимия, т. 46, в. 6, с. 1109—

11! 8.

2. Poznansky М. Y. Czecansky S. Cholestегоl movement between human skin fibrolleus

and phosphotidylcholine vesicles. Biochimica

et Biophysica asta. 1982, ч. 680, р. 182 — 180.

3. Rothblat Ci. Н., Phillips М. С. Mechanism of cholestегоe efflux from cells. effects

of acceptor structure and concentration.—

Journal of Biological Chemistry, 1952, v. 287, № 9, р. 4775 — 4782.

„„SU„„1183118 д (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАГEHTA ХОЛЕСТЕРИНА путем смешивания фосфатидилхолина и детергента, отлича ощийся тем, что, с целью повышения емкости по холестерину, суспензию, содержащую 1 мас. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1 — 0,4 мас. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой

2000 — 9000 в массовом соотношении 1 — 9:

:1 — 4 и 0,002 — 0,04 мас. ч. цетилтриметиламмонийбромида, при содержании фосфатидилхолина 10 — 35 мг/мл облучают ультразвуком при 0 — 4С в течение I — 10 мин.

1183118

Изобретение относится к медицинской химии, а именно к способам получения экстрагентов, обладающих способностью извлекать холестерин из мембран липопротеидов крови, форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов) и клеток стенки кровеносных сосудов.

Известен способ получения липосом из фосфатидилхолина яичных желтков в качестве экстрагента холестерина из мембран микросом печени. Согласно способу экстра.— гент получают облучением яичного фосфатидилхолина ультразвуком с последующим центрифугированием для удаления недиспергированного фосфатидилхолина (1) .

Известен также способ получения экстрагента холестерина из мембран фибробластов кожи в виде липосом из яичного фосфатидилхолина (2) .

Недостатком липосом из фосфатидилхолина яичных желтков как экстрагента холестерина является их небольшая емкость по холестерину и низкая стабильность, в результате чего при хранении липосомы необратимо аггрегируют и выпадают в осадок.

Известен способ получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента в виде смешанных мицелл фосфатидилхолина яичных желтков и натриевой соли таурохолевой кислоты, заключающийся в растворении фосфатидилхолина яичных желтков и таурохолата натрия в метаноле при соотношении фосфатидилхолин: таурохолат 1:2, упаривании метанола, добавлении забуференного водного раствора и интенсивном перемешивании до просветления (3).

Недостатком известного способа является низкая емкость получаемого экстрагента по холестерину, а также выраженное токсическое действие солей холевых кислот, являющихся жесткими анионными детергентами, на биологические мембраны.

Цель изобретения — повышение емкости экстрагента по холестерину.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения экстрагента холестерина путем смешивания фосфатидилхолина и детергента суспензию, содержащую

1 мас. ч. фосфатидилхолина из соевых бобов, 0,1 — 0,4 мас. ч. смеси полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля с мол. массой 2000—

9000 в массовом отношении 1 — 9:1 — 4 и

0,002 — 0,04 мас, ч. цетилтриметиламмонийбромида при содержании фосфатидилхолина

10 — 25 мг/мл облучают ультразвуком при

1 — 4 С в течение — 10 мин.

Пример. В круглодонную колбу объемом

500 мл помещают 5 г фосфатидилхолина соевых бобов, добавляют 50 мл диэтилового эфира, закрывают колбу пробкой и перемешивают содержимое до полного растворения фосфатидилхолина. Диэтиловый эфир упаривают на роторном испарителе при 40 С.

1О !

Приливают к содержащемуся на стенках колбы фосфатидилхолину 200 мл водного раствора, содержащего I г смеси полипропиленгликоля (ППГ) и пол иэтиленгликоля (ПЭГ) (массовое соотношение 9:1) с мол. м.

2000 и 0,05 r цетилтриметиламмонийбромида.

Смесь ППГ и ПЭГ в соотношении 9:1 (мол. м. 2000) выпускается фирмой «Серва» (ФРГ) как неионный детергент «Плюроник

L-61». Кроме детергента «Плюроник L-61» при производстве экстрагента могут быть использованы аналогичные ППГ и ПЭГ—

«Плюроник 1 -61» (соотношение ППГ:ПЭГ=

=3:2, мол. м. 3000) и «Плюроник F-68» (соотношение ППГ:ПЭГ=I:4, мол. м. 9000).

При использовании указанных детергентов класса «Плюроник» могут быть получены экстрагенты, извлекающие большие количества холестерина и имеющие меньшую токсичность, чем известные.

Таким образом, смеси ППГ и ПЭГ могут иметь мол. м. 2000 — 9000, а соотношение

ППГ и ПЭГ возможно 1:9 — 1:4. Иные детергенты на основе ППГ и ПЭГ с отличным соотношением ППГ и ПЭГ не выпускаются промышленностью.

Интенсивно перемешивают содержимое вплоть до полного отделения фосфатидилхолина от стенок колбы и его солюбилизации. Образующуюся мутную жидкость молочного цвета переносят порциями по

20мл в стеклянные стаканы на 50 мл, которые помещают в водяной бане со льдом, и воздействуют ультразвуком на ультразвуковом дезинтеграторе дробно по 30 с с перерывами в 1 мин до получения прозрачной опалесцирующей жидкости. Общее время воздействия ультразвука 5 мин. Полученную жидкость центрифугируют при 20.000)(g в течение 15 мин с целью удаления кусочков металла, попадающего с наконечника ультразвукового дезинтегратора. Полученный экстрагент ампулируют под током азота и хранят в ампулах объемом 10 мл при 0 — 4 С.

Полученный экстрагент имеет положительный заряд и содержит 25 мг фосфатидилхолина в 1 мл. Массовое соотношение фосфатидилхолина смеси полимеров и цетилтриметиламмонийбронида 1:0,2:0,01.

Экстрагент имеет положительный заряд и извлекает ЗОЯ холестерина in vitro из мембран эритроцитов в следующих стандартных условиях. Соотношение тени эритроцитов: экстрагент по фосфолипиду 1:2, время инкубации 3 ч, температура 37 С, состав инкубационной среды 100 мМ трис-HCI буфер, рН 7,4, 0,5 мл этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА); 3 мг фосфолипида теней эритроцитов; 6 мг фосфолипида экстрагента; объем инкубационной смеси 3.5 мл. При исследовании острой токсичности экстрагента на белых мышах — самцах весом 16—

l8 г при внутрибрюшном способе введения экстрагента 1.Dso составляет 90 мкл/г веса животного.

1 183118

20

Таблица 1

Смешанные мицеллы яичного фосфатидилхолина и таурохолата натрия (прототип) Липосомы

Положительно заПоказатели из яичного фосфатидилхолина (аналог) ряженные мицеллы соевого фосфатидилхолина (предлагаемый способ) Извлечение холестерина (%) 25 +3

35+3 (0,05

45 +4 (. 0,02

< 0,05

П р и м е ч а н и е: P — достоверность различий между предлагаемым

1 способом и аналогом, между прототипом и аналогом. Р— достоверность различия между предлагаемым способом и прототипом.

Таблица 2

ХС/ФЛ эритроцитов моль/моль

ХС/ФЛ тромбоцитов моль/моль

Общий ХС/ЛВП-ХС Площадь стенки

Группы животных

ЛВП-ХС аорт, покрытая отложениями ипидов

Опытная

n=7

О, 66 + О, 07 О, 92 +0, 09

6,1+0,6

14+ 2,5

Контрольная п=7

О, 82 + О, 08 О, 99 «+ О, 08

11+1,3

34 *4,3

В табл. 1 приводятся сравнительные данные по извлечению холестерина из мембран эритроцитов кроликов экстрагентами на основе фосфатидилхолина, получаемыми согласно предлагаемому способу, прототипу и аналогу.

В табл. 2 приводится отношение ХС/ФЛ в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекс атерогентности и площадь стенки аорт, занимаемая отложениями липидов в опытной и контрольной группах животных.

Экстрагент вводят крол икам — самцам породы Шиншилла весом 2,5 — 4 кг с экспериментальнымм атеросклерозом. Контрол ьная группа животных находится в режиме спонтанной регрессии экспериментального атеросклероза. Экстрагент вводят животным внутривенно медленно в течение месяца по

3 — 4 инъекции в неделю в общей дозе на одного животного, равной 200 мл экстрагента.

Об извлечении холестерина из биологических мембран при введении экстрагента судят по уменьшению отношения холестерин/фосфолириды (ХС/ФЛ) в мембранах эритроцитов и тромбоцитов, индекса атероген ности.

Общий ХС вЂ” ЛВП вЂ” ХС

ЛВП вЂ” ХС и площади стенки аорт, за нимаемой отложениями липидов у животных, получавших экстрагент по отношению к животным контрольной группы.

Результаты свидетельствуют, что получаемый по предлагаемому способу экстрагент способен извлекать холестерин из мембран эритроцитов, тромбоцитов, липопротеидов крови и клеток стенки кровеносных сосудов при внутривенном введении животным с экспериментальным атеросклерозом.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать экстрагент на основе фосфатидилхолина, обладающий повышенной емкостью по холестерину и способный извлекать холестерин как in vitro, так и

in vivo.